本發(fā)明涉及海洋農(nóng)業(yè)中貝類遺傳育種領(lǐng)域，特別涉及一種人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法。

背景技術(shù)：

1、皺紋盤鮑(haliotisdiscushannai)是我國一種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類，近年來已逐步成為我國南方海區(qū)鮑類養(yǎng)殖的主要品種。

2、由于三倍體鮑的配子為非整倍體，其用于性腺發(fā)育的代謝能全部用于生長，因此，三倍體鮑有個(gè)體大、生長快、肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，且由于其不育性和雜合性而表現(xiàn)出更好的生長和抗逆性。因此，三倍體鮑具有巨大的市場潛力和商業(yè)價(jià)值，能夠大大加快產(chǎn)品上市時(shí)間且得到質(zhì)量更高的個(gè)體。

3、鮑三倍體誘導(dǎo)常用的方法主要是物理法和化學(xué)法，包括冷休克法、靜水壓法、藥物誘導(dǎo)法，均可通過阻斷減數(shù)分裂誘導(dǎo)出最具商業(yè)價(jià)值的同源和異源三倍體鮑?；蛘咭部赏ㄟ^交配四倍體鮑和二倍體鮑來產(chǎn)生三倍體個(gè)體，但目前四倍體成體存活率并不高，很難進(jìn)行推廣?；瘜W(xué)法誘導(dǎo)存在藥物殘留及毒性問題，且幼蟲致畸率較高。

4、為了解決上述技術(shù)難題，本申請?zhí)岢隼脺囟刃菘朔ㄈ斯ふT導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體。相較于現(xiàn)有技術(shù)而言，溫度休克法設(shè)備簡便、價(jià)格低廉，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。此法選育出的皺紋盤鮑三倍體具有耐熱性，可減少漁戶因鮑度夏難而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開展皺紋盤鮑三倍體誘導(dǎo)技術(shù)研究，生產(chǎn)皺紋盤鮑三倍體苗種，對推動(dòng)我國皺紋盤鮑產(chǎn)業(yè)技術(shù)升級具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，通過該方法可高效獲得皺紋盤鮑三倍體。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述的技術(shù)目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

3、本發(fā)明提供了一種人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，包括如下步驟：

4、將精子和卵子混合，進(jìn)行人工受精；受精15min后，將受精卵置于預(yù)熱的海水中進(jìn)行熱休克處理，以抑制受精卵第二極體的排出；熱休克處理的溫度為26～31℃，時(shí)間為10～15min。

5、作為優(yōu)選，精子與卵子的體積比為(9～11)：1。

6、在本發(fā)明提供的具體實(shí)施例中，精子與卵子的體積比為10：1。

7、作為優(yōu)選，受精15min后，對受精卵進(jìn)行熱休克處理。

8、作為優(yōu)選，熱休克處理的溫度為28～30℃，時(shí)間為10～15min。

9、更優(yōu)選地，熱休克處理的溫度為28～30℃，時(shí)間為12～15min。

10、本發(fā)明提供了一種人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法。該方法包括如下步驟：

11、1)種鮑的促熟及選擇：取殼長為65mm～80mm，個(gè)體活力良好且無外部損傷的皺紋盤鮑作為種鮑，按雌雄分別放置于種鮑培育池中促熟，從中選擇出性腺發(fā)育良好且飽滿的二倍體鮑；按雌雄分別放置于種鮑培育池中促熟，從中選擇出性腺發(fā)育良好且飽滿的二倍體鮑；所述種鮑為3齡皺紋盤鮑；所述性腺發(fā)育良好的雌性個(gè)體的性腺接近墨綠色，性腺飽滿；所述倍性確定的方法是剪取鮑部分上足觸手用于流式細(xì)胞儀檢測。所述種鮑培育池內(nèi)性別特征必須單一。

12、2)人工催產(chǎn)：將種鮑陰干2h～2.5h后，將雌雄個(gè)體嚴(yán)格區(qū)分置于不同水箱中，注入照射強(qiáng)度為800～1200mwh/l紫外線處理海水，每隔1h更換一次海水直至配子排放，期間注意防止意外受精并及時(shí)查看種鮑情況；

13、3)配子的選擇和混合受精：使用300目的篩絹濾除步驟2)配子中的雜質(zhì)，鏡檢選擇質(zhì)量高的卵子和活力強(qiáng)的精子。將活力好的精子和質(zhì)量高的卵子以質(zhì)量比為(9～11)︰1進(jìn)行混合，分為處理組和對照組，此時(shí)受精溫度可為18～22℃，鹽度為30～35；

14、4)熱休克誘導(dǎo)：配子受精15min后觀察到受精卵出現(xiàn)第一極體比例為60％～80％時(shí)，將受精卵收集至溫度為26～31℃海水中處理10～15min；

15、5)孵育：熱休克結(jié)束后立即將受精卵收集至18～22℃孵育水箱中，按照常規(guī)孵化及后期培育方法進(jìn)行孵育，后續(xù)使用流式細(xì)胞儀確定擔(dān)輪幼蟲三倍體率。

16、本發(fā)明具有的技術(shù)效果為：

17、本發(fā)明制備人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，實(shí)現(xiàn)了熱休克誘導(dǎo)可培育出人工三倍體鮑苗，提高了多倍體育苗效率。與已有鮑三倍體制備方法相比，本發(fā)明通過改良親鮑催產(chǎn)方式、優(yōu)化誘導(dǎo)條件(熱休克處理溫度及時(shí)間)，從而實(shí)現(xiàn)皺紋盤鮑三倍體的高效穩(wěn)定獲得。本技術(shù)操作方便、高效實(shí)用，便于大量推廣。此法選育出的皺紋盤鮑三倍體具有耐熱性，可減少漁戶因鮑度夏難而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。在皺紋盤鮑生產(chǎn)和多倍體選育優(yōu)良品種上具有重大應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

18、1、高效催產(chǎn)方式：采用陰干結(jié)合紫外線照射海水刺激的方法，確保種鮑能順利排出高質(zhì)量配子，便于后續(xù)受精及誘導(dǎo)。

19、2、優(yōu)化誘導(dǎo)條件：精卵混合5min后，不段使用普通光學(xué)顯微鏡連續(xù)觀察受精卵情況。受精約15min后，當(dāng)?shù)谝粯O體出現(xiàn)60％～80％時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)處理，確保實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性，提高三倍體率。

20、3、簡單無害的誘導(dǎo)方式：熱休克誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，設(shè)備簡便、價(jià)格低廉，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)特征：

1.一種人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，將精子和卵子混合，進(jìn)行人工受精；受精15min后，觀察到受精卵出現(xiàn)第一極體比例為60％～80％時(shí)，將受精卵置于預(yù)熱的海水中進(jìn)行熱休克處理，以抑制受精卵第二極體的排出；熱休克處理的溫度為26～31℃，時(shí)間為10～15min。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，在步驟1)中，所述種鮑的促熟及選擇的具體方法為：取殼長為65mm～80mm，個(gè)體活力良好且無外部損傷的皺紋盤鮑作為種鮑，按雌雄分別放置于種鮑培育池中促熟，從中選擇出性腺發(fā)育良好且飽滿的二倍體鮑；所述種鮑為3齡皺紋盤鮑。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于在步驟2)中，所述人工催產(chǎn)的具體方法為：采用陰干結(jié)合紫外線照射海水刺激的方法對性腺發(fā)育成熟的個(gè)體進(jìn)行催產(chǎn)，直至雌雄種鮑產(chǎn)卵和排精為止；所述陰干結(jié)合紫外線照射海水刺激的方法為：種鮑陰干2h～2.5h后，將雌雄個(gè)體嚴(yán)格區(qū)分置于不同水箱中，注入照射強(qiáng)度為800～1200mwh/l紫外線處理海水，每隔1h更換一次海水直至配子排放，期間注意防止意外受精并及時(shí)查看種鮑情況。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于在步驟3)中，所述配子的選擇的具體方法為：使用300目的篩絹濾除步驟2)配子中的雜質(zhì)，鏡檢選擇質(zhì)量高的卵子和活力強(qiáng)的精子；所述質(zhì)量高的卵子是指新鮮卵液中的卵子應(yīng)卵膜完整、形狀規(guī)則且不存在意外受精；所述活力好的精子是指活動(dòng)性和分散度良好的新鮮精子。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于在步驟3)中，所述混合受精的具體方法為：將確定的活力好和質(zhì)量高的精子和卵子混合，分為處理組和對照組，所述精子與卵子的質(zhì)量比為(9～11)︰1；所述受精溫度為18～22℃，鹽度為30～35。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，在步驟4)中，熱休克誘導(dǎo)過程中持續(xù)監(jiān)控海水溫度的穩(wěn)定性，并使用顯微鏡不斷觀察受精卵的發(fā)育情況。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法，其特征在于，在步驟5)中，所述孵育的具體方法為：熱休克結(jié)束后立即將受精卵收集至18～22℃孵育水箱中；按照常規(guī)孵化及后期培育方法進(jìn)行，后續(xù)使用流式細(xì)胞儀確定擔(dān)輪幼蟲三倍體率。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及貝類遺傳育種領(lǐng)域，特別涉及一種人工誘導(dǎo)皺紋盤鮑三倍體的方法。該方法包括以下步驟：1)種鮑的促熟及選擇：選取無病害種鮑置于種鮑培育池中同步促熟，從中選擇性腺發(fā)育良好的二倍體鮑；2)人工催產(chǎn)：將挑選的種鮑進(jìn)行催產(chǎn)，至雌雄種鮑產(chǎn)卵和排精為止；3)配子的選擇和混合受精：分別濾除精卵中的雜質(zhì)，將精子與卵子混合進(jìn)行人工受精，得受精卵；4)熱休克誘導(dǎo)：受精15min后，將受精卵置于預(yù)熱溫度為26～31℃的海水中處理10～15min，以抑制受精卵第二極體的排出；5)孵育：熱休克結(jié)束后立即將受精卵收集至孵育水箱中進(jìn)行孵化培育。此法選育出的皺紋盤鮑三倍體具有耐熱性，可減少漁戶因鮑度夏難而導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失。通過改良種鮑催產(chǎn)方式，優(yōu)化誘導(dǎo)條件，可實(shí)現(xiàn)皺紋盤鮑三倍體的高效穩(wěn)定獲得。

技術(shù)研發(fā)人員：狄桂蘭,陳新華,蔣明媚,張宇,楊威龍,武云龍,馬澤淵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建農(nóng)林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21