重組人角質(zhì)細(xì)胞因子kgf-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人角質(zhì)細(xì)胞因子KGF-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應(yīng)用。具體涉及一種KGF-2硅質(zhì)體為核心的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)、其制備方法及應(yīng)用。所述傳遞系統(tǒng)包含1.2～3.5重量％的KGF-2、1～10重量％的有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)、6～20重量％的保護(hù)劑和1～5重量％的凝膠基質(zhì)。該KGF-2硅質(zhì)體采用薄膜水化超聲法制備，并進(jìn)一步制備成環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明產(chǎn)品可明顯提高KGF-2穩(wěn)定性，延長(zhǎng)KGF-2在眼內(nèi)滯留的時(shí)間，有利于KGF-2的吸收和利用，對(duì)各類角膜潰瘍具有良好的修復(fù)作用，也能滋潤(rùn)眼球緩解干眼癥癥狀，同時(shí)對(duì)眼部疲勞具備良好的舒緩作用，另外亦適用于其他口腔黏膜、粘膜創(chuàng)傷及皮膚美容治療后的修復(fù)。
【專利說(shuō)明】重組人角質(zhì)細(xì)胞因子KGF-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程藥物制劑領(lǐng)域，公開(kāi)了一種重組人角質(zhì)細(xì)胞因子KGF-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應(yīng)用。具體涉及一種以KGF-2硅質(zhì)體為核心的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)、其制備方法及應(yīng)用。該KGF-2硅質(zhì)體采用薄膜水化超聲法制備，并進(jìn)一步制備成環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 (KGF-2)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族中第10個(gè)成員，是機(jī)體內(nèi)自身存在的多肽生長(zhǎng)因子，KGF-2為單拷貝基因，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，定位于15號(hào)染色體，是一條單鏈多肽，含有5個(gè)半胱氨酸殘基，其中4個(gè)半胱氨酸形成2對(duì)二硫鍵，另一個(gè)半胱氨酸在折疊的肽中，為β 2三葉草型。[0003]臨床上KGF-2可以用于治療多種表皮損傷相關(guān)疾病。美國(guó)Human Genome Sciences公司開(kāi)發(fā)的KGF-2用于治療癌癥患者骨髓移植前高劑量化療引起的黏膜炎、潰瘍性結(jié)腸炎、慢性靜脈潰瘍，已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)研究。國(guó)內(nèi)上海新生源公司開(kāi)發(fā)的KGF-2用于燒燙傷的治療，進(jìn)入III期臨床。然而，KGF-2蛋白的生物制備主要存在兩大缺陷:(l)KGF-2普遍表達(dá)量低(以大腸桿菌為宿主菌，表達(dá)量不足菌體總蛋白的5重量％ )，這嚴(yán)重制約了該藥的規(guī)?；a(chǎn)并造成了產(chǎn)品的價(jià)格非常昂貴，影響了其廣泛使用；(2)KGF-2與其他蛋白藥物一樣對(duì)熱和酸均不穩(wěn)定，在體內(nèi)的半衰期僅為數(shù)分鐘，全身應(yīng)用則會(huì)被快速滅活而難以發(fā)揮其有效作用，局部穿刺給藥對(duì)深部神經(jīng)有損傷且難以保證每次釋藥部位的準(zhǔn)確性，且不適宜長(zhǎng)期用藥。
[0004]角膜位于眼球前面，質(zhì)地透明表面光滑無(wú)血管，直接與外界接觸，易受損傷和感染，因而角膜疾病較為多見(jiàn)，也是致盲的重要原因。常見(jiàn)的外傷性角膜上皮缺損由化學(xué)燒傷、機(jī)械擦傷、手術(shù)等多原因引起，如果不能得到及時(shí)有效的治療，重者可導(dǎo)致角膜潰瘍或融解，甚至發(fā)生穿孔，嚴(yán)重影響視功能。傳統(tǒng)的治療方法雖有一定效果，但仍不夠理想。感染性角膜炎臨床上主要是采用抗生素療法，控制感染后靠?jī)?nèi)源性生長(zhǎng)因子促進(jìn)角膜愈合，但愈合質(zhì)量差，而且病程長(zhǎng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面越遲愈合越容易形成瘢痕。因角膜沒(méi)有血管，基質(zhì)的修復(fù)過(guò)程比其他組織緩慢，所以使傷口盡快愈合就顯得十分重要，而KGF-2可加快上皮及基質(zhì)細(xì)胞的增殖，對(duì)瘢痕的減少有積極的意義。
[0005]目前臨床上可供選用的促角膜上皮損傷修復(fù)的有效藥物并不多見(jiàn)，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上基因工程藥物主要是貝復(fù)舒(重組牛bFGF滴眼劑)和金因舒(重組人EGF滴眼劑)。貝復(fù)舒開(kāi)創(chuàng)了國(guó)內(nèi)治療角膜上皮損傷藥物的新紀(jì)元，主藥是重組牛bFGF，該藥在臨床上用于因角膜上皮損傷引起的重癥干眼癥的治療取得很好的療效。但重組牛bFGF，因是牛源基因，對(duì)人的適應(yīng)性差，不適合長(zhǎng)期用藥。金因舒開(kāi)創(chuàng)了“主動(dòng)修復(fù)”的新紀(jì)元，主要藥效成分是重組人表皮生長(zhǎng)因子衍生物(rhEGF)，適用于各種原因引起的角結(jié)膜上皮損傷的修復(fù)、各種內(nèi)眼術(shù)后眼表的重建及限表護(hù)理。但bFGF和EGF在促進(jìn)角膜上皮損傷愈合的同時(shí)，也會(huì)促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)，愈合后留有薄翳、斑翳或白斑，對(duì)視力有不同程度影響。雖然角膜細(xì)胞可分泌一定的KGF-2，但及時(shí)修復(fù)仍需補(bǔ)充外源性的KGF-2，以促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞的增殖和移行。鑒于KGF-2對(duì)上皮組織具有高度特異性，同時(shí)對(duì)對(duì)損傷引起的角膜新生血管的生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用，這與目前上市的生長(zhǎng)因子類滴眼液相比，KGF-2優(yōu)勢(shì)明顯。
[0006]硅質(zhì)體是一種新的制劑技術(shù)和藥物載體，它結(jié)合了脂質(zhì)體和二氧化硅載體的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了它們各自的缺陷，是目前比較理想的一種藥物載體。硅質(zhì)體與傳統(tǒng)的脂質(zhì)體囊泡相比，是一種非常穩(wěn)定的囊泡結(jié)構(gòu)，是有機(jī)-無(wú)機(jī)的雜化材料。它是由含有硅醚基團(tuán)的類脂質(zhì)化合物(即，有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì))在水溶液中，經(jīng)過(guò)溶膠-凝膠(sol-gel)自組裝過(guò)程，聚集形成穩(wěn)定形態(tài)的雙層囊泡。同時(shí)囊泡表面包裹一層三維網(wǎng)狀硅酸鹽的結(jié)構(gòu)，用穩(wěn)定的S1-C鍵將無(wú)機(jī)層和有機(jī)二分子體連接在一起。結(jié)構(gòu)上的這一特點(diǎn)，使囊泡具有很高的穩(wěn)定性。本發(fā)明用有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)來(lái)包裹KGF-2，對(duì)制備方法和制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，開(kāi)發(fā)出了具有高穩(wěn)定性、緩釋特性的KGF-2硅質(zhì)體眼部智能傳遞系統(tǒng)，對(duì)KGF-2的臨床應(yīng)用具有重大意義。
[0007]本項(xiàng)目課題組前期利用SUMO融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了 KGF-2的高效表達(dá)，在此技術(shù)上采用制劑學(xué)新技術(shù)制備了 KGF-2硅質(zhì)體，并進(jìn)一步制備成環(huán)境敏感型智能眼部給藥系統(tǒng)，活性保存率超過(guò)50 %，半衰期延長(zhǎng)6倍以上。(美國(guó)人類基因組公司噴霧劑進(jìn)入11期臨床試驗(yàn) E.coli 系統(tǒng)表達(dá)量 4.8%，Nham SU et al.Biotechnol Lett, 1990,16 (7):661-7.；美國(guó)Amgen公司靜脈注射液Kepivance? E.coli系統(tǒng)表達(dá)量4.2%, Zazo M.et al.Gene,1992，113 (2):231-7 ;上海新生源、溫州醫(yī)學(xué)院，凍干粉進(jìn)入III臨床E.coli系統(tǒng)表達(dá)量4.5%酵母系統(tǒng)表達(dá)量3.7% )。實(shí)驗(yàn)證實(shí)KGF-2硅質(zhì)體眼部智能傳遞系統(tǒng)對(duì)各種原因引起的角膜上皮缺損和點(diǎn)狀角膜病變，復(fù)發(fā)性淺層點(diǎn)狀角膜病變、輕中度干眼癥、大泡性角膜炎、角膜擦傷、輕中度化學(xué)燒傷、角膜手術(shù)及術(shù)后愈合不良、地圖狀(或營(yíng)養(yǎng)性)單庖性角膜潰瘍等有修復(fù)治療作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人角質(zhì)細(xì)胞因子KGF-2環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)及其應(yīng)用。具體涉及一種KGF-2硅質(zhì)體為核心的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)、其制備方法及應(yīng)用。該KGF-2硅質(zhì)體采用薄膜水化超聲法或乙醇溶膠注入法制備，并進(jìn)一步制備成環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明產(chǎn)品可明顯提高KGF-2穩(wěn)定性，延長(zhǎng)KGF-2在眼內(nèi)滯留的時(shí)間，有利于KGF-2的吸收和利用。對(duì)各類角膜潰瘍具有良好的修復(fù)作用，也能滋潤(rùn)眼球緩解干眼癥癥狀，同時(shí)對(duì)眼部疲勞具備良好的舒緩作用，另外亦適用于其他口腔黏膜、粘膜創(chuàng)傷及皮膚美容治療后的修復(fù)。
[0009]在第一方面中，本發(fā)明提供了一種重組人角質(zhì)細(xì)胞因子KGF-2硅質(zhì)體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含1.2~3.5重量％的1---2、1~10重量％的有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)、6~20重量％的保護(hù)劑和I~5重量％的凝膠基質(zhì)。
[0010]其中所述的重組人KGF-2選自基因工程發(fā)酵純化提取的KGF-2，其宿主菌選自大腸桿菌 BL21(DE3)、BL21(DE3)rosatta、BL21 (DE3) plyss，優(yōu)選 BL21 (DE3)菌株。用于本發(fā)明的重組人KGF-2的氨基酸序列為SEQ ID N0.1所示。
[0011]其中所述的有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)選自下式1-4中的任一種:[0012]
【權(quán)利要求】
1.一種重組人角質(zhì)細(xì)胞因子KGF-2硅質(zhì)體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，包含1.2~3.5重量％的重組人KGF-2蛋白、I~10重量％的有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)、6~20重量％的保護(hù)劑和I~5重量％的凝膠基質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，其中所述的重組人KGF-2的氨基酸序列為SEQ ID NO =10
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，其中所述有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)選自下式1-4中的任一種:
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，其中所述的硅質(zhì)體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)為溫度敏感型、PH敏感型或離子敏感型，優(yōu)選離子敏感型眼部傳遞系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)，其中所述硅質(zhì)體平均粒徑為100-300nm，優(yōu)選 150nm。
6.一種制備權(quán)利要求1所述的重組人角質(zhì)細(xì)胞因子KGF-2硅質(zhì)體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)的方法，所述方法包含以下步驟: (1)表達(dá)并純化重組人KGF-2蛋白； (2)利用選自下式1-4中的任一種的有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合脂質(zhì)制備空白硅質(zhì)體:
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(2)的空白硅質(zhì)體通過(guò)薄膜水化超聲法或乙醇溶膠注入法制備。
8.權(quán)利要求1的重組人角質(zhì)細(xì)胞因子KGF-2硅質(zhì)體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)在制備用于治療受試者中的角膜損傷或病變的藥物中的應(yīng)用，其中所述角膜損傷或病變?yōu)楦鞣N原因引起的角膜損傷或病變，包括，角膜上皮缺損和點(diǎn)狀角膜病變、復(fù)發(fā)性淺層點(diǎn)狀角膜病變、輕中度干眼癥、大泡性角膜炎、角膜擦傷、輕中度化學(xué)燒傷、角膜手術(shù)及術(shù)后愈合不良或地圖狀(或營(yíng)養(yǎng)性)單庖性角膜潰瘍。
9.權(quán)利要求1的重組人角質(zhì)細(xì)胞因子KGF-2硅質(zhì)體環(huán)境敏感型眼部傳遞系統(tǒng)在制備美容劑中的應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】A61P27/02GK103656622SQ201310648460
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】黃亞?wèn)|, 曲紅艷, 項(xiàng)琪, 蘇志堅(jiān), 李校堃, 王曉杰 申請(qǐng)人:廣東暨大基因藥物工程研究中心有限公司, 暨南大學(xué)