專利名稱:水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及利用高山被孢霉(Mortierella alpina)生產(chǎn)花生四烯(Arachidonic acid,簡稱ARA)油脂的工藝,屬于生物工程領(lǐng)域。具體地說,利用生物酶破碎高山被孢霉的 細(xì)胞壁,從而提取花生四烯酸油脂的方法,是生物工程下游過程中分離提取的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
花生四烯酸(Arachidonic acid,ARA,即5,8,11,14-二十碳四烯酸)屬于ω-6系 列長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs),是一種人體最活躍和必需的多不飽和脂肪酸,具有促進(jìn)智 力發(fā)育、提高人體視力、降低血脂、增強(qiáng)免疫力和抗癌等功效,被廣泛應(yīng)用于功能保健、生物 醫(yī)藥、化妝品及飼料添加劑等方面。由于花生四烯酸油脂在成年人體內(nèi)合成量極少,嬰幼兒 體內(nèi)則無法合成,因此從食物中攝取額外的花生四烯酸油脂對(duì)人體許多組織特別是腦組織 的生長發(fā)育至關(guān)重要。花生四烯酸油脂的傳統(tǒng)來源是從動(dòng)物肝臟、豬腎上腺、血液、魚油中提取,但動(dòng)物 組織中的花生四烯酸油脂含量很低(約為0.2% ),來源少,且受季節(jié)限制,價(jià)格昂貴,無 法滿足日益增長的市場需求。微生物合成花生四烯酸油脂以生產(chǎn)周期短、環(huán)境污染小、 原料來源廣泛、可持續(xù)發(fā)展性強(qiáng)和產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)逐漸替代了傳統(tǒng)花生四烯酸油脂的 制備方法,其中以高山被孢霉(Malpina)的花生四烯酸油脂含量最高(Higashiyama K, Biotechnology and Bioprocess Engineering,2002,7 :252_262),且利用高山被孢霉生產(chǎn) 花生四烯酸油脂已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。因此,花生四烯酸油脂的提取工藝成為微生物合成法工 業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)必要環(huán)節(jié)。從高山被孢霉中提取花生四烯酸油脂的方法主要有(1)索式提取法,發(fā)酵液抽 濾集菌,烘干研碎,裝入索式提取器,正己烷加熱回流提取十二小時(shí),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷 即得油脂。(2)有機(jī)溶劑萃取法,發(fā)酵液抽濾集菌,按一定比例加入有機(jī)溶劑(常用的有石 油醚,乙醇 正己烷,氯仿 甲醇,乙醚),振蕩混勻,離心取有機(jī)相,蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑即得 油脂。(3)超聲波提取法,發(fā)酵液超聲波破解細(xì)胞壁,加入機(jī)溶劑萃取,離心取有機(jī)相,蒸發(fā) 去除有機(jī)溶劑即得油脂。(4)超臨界CO2萃取法,發(fā)酵液抽濾集菌,烘干研碎,裝入萃取管, 超臨界狀態(tài)下分離出油脂。但是,這些油脂提取方法存在著種種缺點(diǎn)與不足(1)索式提取法,耗時(shí)長,冷卻 水用量大,難以批量提取,僅局限在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的油脂提取。(2)有機(jī)溶劑法油脂收率低,油 脂品質(zhì)差,對(duì)花生四烯酸而言,有機(jī)溶劑的殘留存在食用安全性的潛在問題。(3)超聲波提 取所需功率大,處理規(guī)模小,難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。(4)超臨界CO2萃取,設(shè)備復(fù)雜,生產(chǎn)成本高, 僅局限在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的油脂提取。因此,需要尋求一種油脂收率高、油脂品質(zhì)高、功效高、能 耗低且易于工業(yè)化的油脂提取方法,利用水酶法對(duì)高山被孢霉菌體進(jìn)行花生四烯酸油脂的 提取工藝未見文獻(xiàn)報(bào)道。水酶法以功效高、油脂品質(zhì)高、能耗低、易于批量化處理等特點(diǎn),日益得到科研界 和工業(yè)界的重視。公開號(hào)CN101307341A利用生物酶對(duì)寇式隱甲藻進(jìn)行油脂提取,論證了酶解法對(duì)海藻細(xì)胞的可行性;公開號(hào)CN101531689A和CN101235399A論證了酶解法對(duì)植物細(xì) 胞的可行性。本發(fā)明以三種蛋白酶(堿性蛋白酶,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶)以及六種多 糖水解酶(纖維素酶,木聚糖酶,果膠酶,糖化酶,淀粉酶和蝸牛酶)為研究重點(diǎn),提供一種 花生四烯酸水酶法提取工藝。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝,以高 效、批量化萃取花生四烯酸油脂,并通過優(yōu)化工藝條件,獲得較高的油脂收率。為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝,包含如下步驟(1)培養(yǎng)高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸;(2)向步驟(1)得到的發(fā)酵液中,加蒸餾水稀釋1 3體積倍數(shù)制成菌體懸浮液, 加入0. 25 2. 5g/L的生物酶,調(diào)節(jié)體系pH值至生物酶的酶解反應(yīng)最適pH,調(diào)節(jié)體系溫度 至生物酶的酶解反應(yīng)最適溫度,進(jìn)行酶解6 10h ;(3)向步驟(2)得到的酶解后的體系中,加入體系體積的10 15% (v/v)的乙醇 和20 40% (v/v)的正己烷進(jìn)行油脂萃取,離心分層,取有機(jī)相;向剩下的水相和固體相 中,加入步驟(2)得到的酶解后體系體積的20 40% (v/v)的正己烷進(jìn)行二次萃取,離心 分層,取有機(jī)相,合并兩次有機(jī)相;(4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)收集的有機(jī)相,得到花生四烯酸油脂。其中,所述的生物酶為纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、糖化酶、淀粉酶、蝸牛酶、木瓜 蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶中的任意一種或幾種。當(dāng)所加入的生物酶為單一酶時(shí),各種酶的酶解條件如下纖維素酶,最適pH為4. 5 5. 5,最適溫度為40 50°C ;木聚糖酶,最適pH為3. 5 5. 5,最適溫度為50 60°C ;果膠酶,最適pH為3. 5 4. 5,最適溫度為50 60°C ;糖化酶,最適pH為4.0 4. 5,最適溫度為60 62°C ;淀粉酶,最適pH為5. 5 6. 5,最適溫度為50 55°C ;蝸牛酶,最適pH為5. 8 7. 2,最適溫度為37 45°C ;木瓜蛋白酶,最適pH為5. 5 6.0,最適溫度為45 65°C ;堿性蛋白酶,最適pH為7. 5 9.0,最適溫度為45 60°C ;中性蛋白酶,最適pH為6. 5 7. 5,最適溫度為45 60°C。當(dāng)所加入的生物酶為多種酶時(shí),采用依次向菌體懸浮液中加入單一酶進(jìn)行酶解的 方式,每一種酶都在其最適PH條件和最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶解,一種酶的反應(yīng)結(jié)束之后, 再加入另外一種酶。本發(fā)明對(duì)每一種酶的比例沒有任何限制,只要求所有酶的總加入量為 0. 25 2. 5g/L。本發(fā)明對(duì)每一種酶的酶解時(shí)間沒有任何限制,只要求所有酶的酶解總時(shí)間 為6 10h。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)(1)水酶法效率高,能耗低,易于批量化大規(guī)模應(yīng)用。相對(duì)于常規(guī)花生四烯酸油脂的提取方法,水酶法易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),和超聲波提取相比,水酶法反應(yīng)條件溫和,效率高,能耗低。和索式提取法相比,可以節(jié)約大量冷卻水 的使用。(2)水酶法反應(yīng)設(shè)備簡易,成本低,適用性強(qiáng)。
水酶法反應(yīng)設(shè)備簡單,實(shí)驗(yàn)室規(guī)??梢灾苯邮褂迷嚬芑驌u瓶進(jìn)行油脂提??;工業(yè) 化規(guī)模可以直接使用花生四烯酸發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵罐進(jìn)行原位酶解提取,不需要對(duì)其進(jìn)行任 何改造,從而使操作成本大大降低,適用性強(qiáng)。(3)水酶法提取花生四烯酸油脂收率高,品質(zhì)高。在水酶法提取工藝的基礎(chǔ)上,通過優(yōu)化工藝條件,相比索式提取法(文獻(xiàn)報(bào)道此 法提油,收率最高)最終獲得90 100%的油脂收率,水酶法提取的油脂,呈金黃色,清澈明 亮,并且油脂中花生四烯酸相對(duì)含量相比索式提取法偏高10 15%。
圖1為本發(fā)明水酶法提取花生四烯酸油脂工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例,可以更好地理解本發(fā)明。然而,本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解,實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明,而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。以下實(shí)施例所用的菌種為高山被孢酶(Mortierella alpine),保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 207067。實(shí)施例1 菌種發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基配方如下種子培養(yǎng)基100g/L葡萄糖,llg/L酵母粉,8g/L玉米漿,3. 8g/L KH2PO4,初始pH 為 5. 0-6. 0。發(fā)酵培養(yǎng)基100g/L葡萄糖,llg/L 酵母粉,3.8g/L KH2PO4, 3. 4g/L NaNO3,0. 5g/ LMgSO4. 7H20。初始 pH 為 5. 5-6. 5。1)菌種活化在制備種子之前,采用PDA斜面進(jìn)行菌種活化,并將活化的菌種轉(zhuǎn)入PDA固體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)3 5天,以積累大量孢子備用。2)種子一次放大將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的高山被孢霉的孢子用無菌水洗脫后,通過無菌操作 接入裝有種子培養(yǎng)基的凹槽搖瓶中。搖瓶裝液量為50ml/250ml。種子培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速 為150rpm,培養(yǎng)溫度為25°C,培養(yǎng)時(shí)間為2 3天。3)種子二次放大將2)中培養(yǎng)的菌種通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基凹槽搖瓶中。凹槽搖瓶裝 液量為100mL/500mL。接種量為5% (ν/ν),即5mL。種子培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速為150rpm,培 養(yǎng)溫度為25°C,培養(yǎng)時(shí)間為3天。4)菌種發(fā)酵培養(yǎng)將3)中培養(yǎng)的菌種通過無菌操作接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的凹槽搖瓶中。凹槽搖裝液量為100mL/500mL。接種量為10% (v/v),即10mL。培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速為150rpm,培養(yǎng) 溫度為25°C,培養(yǎng)時(shí)間為7 8天。實(shí)施例2 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為6. 0,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入蝸牛酶20mg,40°C恒溫振蕩8 小時(shí);加乙醇4mL和10mL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的 水相和固體相中,加10mL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4854g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g,油脂收 率為97. 2%。實(shí)施例3 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為6. 0,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入蝸牛酶20mg,37°C恒溫振蕩8 小時(shí);加乙醇4. 5mL和10mL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下 的水相和固體相中,加10mL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4752g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g,油脂 收率為95. 1%0實(shí)施例4 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為6. 0,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入蝸牛酶20mg,45°C恒溫振蕩8 小時(shí);加乙醇3mL和12mL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的 水相和固體相中,加12mL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4823g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g,油脂收 率為96. 6%。實(shí)施例5 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)pH值為7. 2,按30mL等量分裝在50mi試管中,加入蝸牛酶20mg,40°C恒溫振蕩8 小時(shí);加乙醇3mL和6mL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的水 相和固體相中,加10mL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4741g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g,油脂收率 為 94. 9%。實(shí)施例6 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋3體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為8. 0,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入堿性蛋白酶40mg,50°C恒溫振 蕩8小時(shí);加乙醇4mL和10mL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩 下的水相和固體相中,加10mL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4472g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4883g,油 脂收率為91.6%。實(shí)施例7 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋3體積倍數(shù)制成菌體懸浮
6液,調(diào)節(jié)PH值為4. 0,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入果膠酶40mg,55°C恒溫振蕩8 小時(shí);加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的 水相和固體相中,加IOmL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4783g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g,油脂收 率為95. 8%。表1是實(shí)施例2 7所提油脂成分分布情況。表 1 實(shí)施例8 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋1體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為4. 8,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入纖維素酶40mg,45°C恒溫振蕩 8小時(shí);加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的 水相和固體相中,加IOmL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4703g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5186g,油脂收 率為90. 7%。實(shí)施例9 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋1體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為5. 5,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入木瓜蛋白酶40mg,55°C恒溫振 蕩8小時(shí);加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩 下的水相和固體相中,加IOmL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4943g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5186g,油 脂收率為95.3%。實(shí)施例10 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為7. 0,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入中性蛋白酶40mg,50°C恒溫振 蕩8小時(shí);加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩 下的水相和固體相中,加IOmL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4685g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4883g,油 脂收率為95. 9%。表2是實(shí)施例8 10所提油脂成分分布情況。表 2 實(shí)施例11 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為4. 0,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入木聚糖酶20mg,55°C恒溫振蕩 8小時(shí);加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的 水相和固體相中,加IOmL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4808g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g,油脂收 率為96. 3%。實(shí)施例12 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為4. 5,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入糖化酶40mg,60°C恒溫振蕩8 小時(shí);加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的 水相和固體相中,加IOmL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4682g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5186g,油脂收 率為90. 3%。實(shí)施例13 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,調(diào)節(jié)PH值為6. 0,按30mL等量分裝在50mL試管中,加入淀粉酶60mg,55°C恒溫振蕩8 小時(shí);加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的 水相和固體相中,加IOmL正己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4465g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g,油脂收 率為89. 4%。表3是實(shí)施例11 13所提油脂成分分布情況。表3脂肪酸種類 _ 油脂中含_ (%)_ 實(shí)施例14 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,按30mL等量分裝在50mL試管中,調(diào)節(jié)ρΗ值為8.0,加入堿性蛋白酶40mg,50°C恒溫振蕩 4小時(shí)后,將pH值調(diào)為4. 0,再加入果膠酶40mg,55°C恒溫振蕩4小時(shí);加乙醇4mL和IOmL 正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的水相和固體相中,加IOmL正 己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四 烯酸油脂0. 5238g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5422g,油脂收率為96. 6%。實(shí)施例15 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,按30mL等量分裝在50mL試管中,調(diào)節(jié)pH值為6. 0,加入蝸牛酶20mg,40°C恒溫振蕩4小 時(shí)后,將PH值調(diào)為7.0,再加入中性蛋白酶40mg,50°C恒溫振蕩4小時(shí);加乙醇4mL和IOmL 正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的水相和固體相中,加IOml正 己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四 烯酸油脂0. 4986g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5075g,油脂收率為98. 2 %。實(shí)施例16 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體,在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液,按30mL等量分裝在50mL試管中,調(diào)節(jié)pH值為6. 0,加入蝸牛酶20mg,40°C恒溫振蕩4小 時(shí)后,將PH值調(diào)為5. 5,再加入木瓜蛋白酶60mg,55°C恒溫振蕩4小時(shí);加乙醇4mL和IOmL 正己烷進(jìn)行第一次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,向剩下的水相和固體相中,加IOml正 己烷二次萃取,5000rpm離心5min取有機(jī)相,合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四 烯酸油脂0. 4225g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4209g,油脂收率為100. 3 %。表4是實(shí)施 例14 16所提油脂成分分布情況。表 權(quán)利要求
一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝,其特征在于,該工藝包含如下步驟(1)培養(yǎng)高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸;(2)向步驟(1)得到的發(fā)酵液中,加蒸餾水稀釋1~3體積倍數(shù)制成菌體懸浮液,加入0.25~2.5g/L的生物酶,調(diào)節(jié)體系pH值至生物酶的酶解反應(yīng)最適pH,調(diào)節(jié)體系溫度至生物酶的酶解反應(yīng)最適溫度,進(jìn)行酶解6~10h;(3)向步驟(2)得到的酶解后的體系中,加入體系體積的10~15%(v/v)的乙醇和20~40%(v/v)的正己烷進(jìn)行油脂萃取,離心分層,取有機(jī)相;向剩下的水相和固體相中,加入步驟(2)得到的酶解后體系體積的20~40%(v/v)的正己烷進(jìn)行二次萃取,離心分層,取有機(jī)相,合并兩次有機(jī)相;(4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)收集的有機(jī)相,得到花生四烯酸油脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝,其特征在于,所述的生 物酶為纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、糖化酶、淀粉酶、蝸牛酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中 性蛋白酶中的任意一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝,其特征在于當(dāng)所加 入的生物酶為單一酶時(shí),各種酶的酶解條件如下纖維素酶,最適pH為4. 5 5. 5,最適溫度為40 50°C ; 木聚糖酶,最適pH為3. 5 5. 5,最適溫度為50 60°C ; 果膠酶,最適pH為3. 5 4. 5,最適溫度為50 60°C ; 糖化酶,最適pH為4. 0 4. 5,最適溫度為60 62V ; 淀粉酶,最適pH為5. 5 6. 5,最適溫度為50 55°C ; 蝸牛酶,最適pH為5. 8 7. 2,最適溫度為37 45°C ; 木瓜蛋白酶,最適pH為5. 5 6. 0,最適溫度為45 65°C ; 堿性蛋白酶,最適pH為7. 5 9. 0,最適溫度為45 60°C ; 中性蛋白酶,最適pH為6. 5 7. 5,最適溫度為45 60°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝,其特征在于當(dāng)所加 入的生物酶為多種酶時(shí),采用依次向菌體懸浮液中加入單一酶進(jìn)行酶解的方式,每一種酶 都在其最適PH條件和最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶解,一種酶的反應(yīng)結(jié)束之后,再加入另外一種
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝,以高山被孢霉為出發(fā)菌株,經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后,加入蒸餾水稀釋制成菌體懸浮液,調(diào)節(jié)懸浮液pH值,加入生物酶恒溫振蕩6~10小時(shí)后,加入乙醇和正己烷進(jìn)行油脂萃取,離心分層后取有機(jī)溶劑相,然后在剩下的水相和固體相中加入正己烷進(jìn)行二次萃取,離心分層后合并有機(jī)溶劑相,有機(jī)溶劑相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即可得到油脂和有機(jī)溶劑。本發(fā)明具有能耗低、成本低、花生四烯酸油脂收率高、品質(zhì)高、反應(yīng)設(shè)備簡易,易于批量大規(guī)模應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C11B1/00GK101870915SQ20101021459
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者叢蕾蕾, 劉欣, 尤江英, 彭超, 紀(jì)曉俊, 路金淼, 黃和, 黎志勇 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)