一種使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸合成酶及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸合成酶及其應(yīng)用，該乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；編碼該乙酰乳酸合成酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。該乙酰乳酸合成酶在水稻品種“CL55”中表達(dá)，與野生型乙酰乳酸合成酶蛋白質(zhì)相比具有4個(gè)突變位點(diǎn)。將編碼乙酰乳酸合成酶的基因轉(zhuǎn)化到植物中編碼乙酰乳酸合成酶，可使轉(zhuǎn)基因植物具有抗咪唑啉酮類除草劑的特性。CGMCC NO.934820140714
【專利說明】
一種使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸合成 酶及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸合成酶及其應(yīng) 用，更具體地涉及一種來源于水稻品種"CL55"的乙酰乳酸合成酶，該乙酰乳酸合成酶的編 碼基因轉(zhuǎn)化植物使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑的特性。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國乃至世界的主要糧食作物，是全球近一半人口的主要熱量來源。在我 國，水稻的種植總面積、總產(chǎn)量和單位面積產(chǎn)量均居各類糧食作物的首位。近年來，由于半 矮桿水稻品種的種植，水稻種植方式由傳統(tǒng)的移栽方式向直播轉(zhuǎn)變，雜草稻隨后蔓延開來 并且日益嚴(yán)重。全國由于雜草對水稻的危害，導(dǎo)致水稻產(chǎn)量損失達(dá)11%，目前，雜草稻已經(jīng) 成為全球水稻田雜草危害的新問題。由于雜草稻同栽培稻親緣關(guān)系密切，尚沒有理想的除 草劑可以安全而有效地控制雜草稻。
[0003] 咪唑啉酮類除草劑選擇性強(qiáng)、廣譜、高活性，經(jīng)根與葉吸收，可進(jìn)行播前混土、苗前 土表處理及莖葉噴霧，即能防除一年生禾本科與闊葉雜草，也能防除多年生雜草。咪唑啉酮 類除草劑在土壤中吸附性小、持效期較長，廣泛用于大豆等旱田作物，它對防除水稻田雜草 稻非常有效。目前通過非轉(zhuǎn)基因手段培育的抗除草劑作物主要是抗咪唑啉酮類作物，其中， 已經(jīng)商品化的有玉米、小麥、油菜、水稻和向日葵等。
[0004] 目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水稻品種"Kinmaze"的乙酰乳酸合成酶蛋白質(zhì)Trp547和SER627 的雙位點(diǎn)突變（Kawai et al. 2007A novel mutant acetolactate synthase gene from rice cells, which confers resistance to ALS-inhibiting herbicides. J. Pestic. Sci，32:89-98)，以及廣東的水稻品種"黃占華"、"黃占絲"的乙酰乳酸合成酶蛋白質(zhì)Ala96、 Trp548、SER627的單位點(diǎn)突變（中國專利CN102586215B)會使水稻獲得抗咪唑啉酮類除草 劑的特性。但是，要從根本上解決水稻直播田雜草稻問題，仍需要培育出具有高效的抗咪唑 啉酮類除草劑特性的轉(zhuǎn)基因植物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸 合成酶及其應(yīng)用，該乙酰乳酸合成酶的編碼基因來源于水稻品種"CL55"（保藏號：CGMCC No. 9348 ;建議的分類命名：粳稻Oryza sativa subsp. japonica ;保藏日期：2014年7月 14日；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號院3號，郵編100101)，將其轉(zhuǎn)化到植物中，使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑的特 性。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -種使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸合成酶，其氨基酸序列如 SEQ ID No :1 所示。
[0008] 所述使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸合成酶的編碼基因，其核苷 酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0009] -種使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸合成酶在培育抗咪唑啉酮 類除草劑植物中的應(yīng)用。
[0010] 進(jìn)一步，所述咪唑啉酮類除草劑是指咪唑乙煙酸（英文名稱：Imazethapyr，化學(xué) 名稱：2_[4, 5-二氫-4-甲基-4- (1-甲基乙基）-5-氧代-1H-咪唑-2-基]-5-乙基-3-吡 啶羧酸）或者甲咪唑煙酸（英文名：Imazameth，化學(xué)名稱：（RS) -2- (4-異丙基-4-甲 基-5-氧-2-咪唑啉-2-基）-5-甲基煙酸）。
[0011] 又，所述植物為水稻或玉米。
[0012] 本發(fā)明所述的乙酰乳酸合成酶蛋白質(zhì)與其他野生型乙酰乳酸合成酶蛋白質(zhì)（其 氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示）相比具有4個(gè)突變位點(diǎn)，將編碼該合成酶的基因轉(zhuǎn)化到 植物中，可使水稻、玉米等植物具有抗咪唑啉酮類除草劑的特性。
[0013] 具體是將本發(fā)明編碼乙酰乳酸合成酶的基因轉(zhuǎn)化到水稻中得到轉(zhuǎn)基因1300-CL55 水稻，在轉(zhuǎn)基因1300-CL55水稻和野生型水稻苗期噴灑咪唑啉酮類除草劑，十天后，野生型 水稻植株全部死亡，而轉(zhuǎn)基因1300-CL55水稻植株全部存活；將編碼乙酰乳酸合成酶的基 因轉(zhuǎn)化到玉米中得到轉(zhuǎn)基因1300-CL55玉米，在轉(zhuǎn)基因1300-CL55玉米和野生型玉米苗期 噴灑咪唑啉酮類除草劑，十天后，野生型玉米植株全部死亡，而轉(zhuǎn)基因 13〇〇-CL55玉米植株 全部存活。因此，含有本發(fā)明如SEQ ID N0 :1所示的乙酰乳酸合成酶的轉(zhuǎn)基因植物具有抗 咪唑啉酮類除草劑的特性。
[0014] 本發(fā)明有益效果：
[0015] 1)本發(fā)明如SEQ ID No :1所示的乙酰乳酸合成酶是在水稻品種"CL55"中表達(dá)出 來的，編碼該合成酶的基因轉(zhuǎn)化到植物中編碼乙酰乳酸合成酶，使轉(zhuǎn)基因植物可以表達(dá)乙 酰乳酸合成酶蛋白質(zhì)，進(jìn)而使轉(zhuǎn)基因植物具有抗咪唑啉酮類除草劑的特性。
[0016] 2)含有本發(fā)明乙酰乳酸合成酶基因的植物安全穩(wěn)定，對植物生長沒有不良影響， 對環(huán)境無污染。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 下列實(shí)施例中如無特殊說明均為《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版）》（科學(xué)出版社， 2002年）、《植物組織培養(yǎng)原理與技術(shù)-》（化學(xué)工程出版社，2009年）、《現(xiàn)代作物栽培學(xué)》 (高等教育出版社，2011年）所記載的方法。本實(shí)施例中，引物DNA的合成和DNA測序委托 上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行，化學(xué)試劑、實(shí)驗(yàn)菌株、分子生物學(xué)試劑盒和酶類從杭 州南天生物科技有限公司購買。組織培養(yǎng)使用的NBDC共培養(yǎng)基、NBDS篩選培養(yǎng)基、MSH)預(yù) 分化培養(yǎng)基、MSD分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基等從杭州萊楓生物科技有限公司購買。
[0019] 實(shí)施例1.確定水稻品種"CL55"中的乙酰乳酸合成酶基因
[0020] 根據(jù)已知的乙酰乳酸合成酶的核酸序列（如SEQ ID N0 :4所示）設(shè)計(jì)引物：AHA S-F: 5' atggctacgaccgccgcggccgcg ;AHAS-R: 5' atacacagtcctgccatcaccatc。使用上述 2 個(gè)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)從水稻品種"CL55"水稻基因組中擴(kuò)增出1935bp條 帶。其中，PCR反應(yīng)體系為：50yl 2x高保真聚合酶（PFU)Mix，4yl AHAS-F(10yM)，4yl AHAS-R(10 y M)，1 y 1 "CL55" 基因組 DNA，41 y 1 去離子水（ddH20)，總體積 100 y 1 ;PCR 反 應(yīng)程序?yàn)椋?.95°C，10 分鐘；2. 95°C，40 秒；3. 52°C，40 秒；4. 68°C，2 分鐘；5.步驟 2 ~4,循 環(huán) 25 次；6. 68°C，10 分鐘；7. 16°C，保存。
[0021] 將PCR產(chǎn)物DNA測序，其序列如SEQ ID N0 :2所示，獲得本發(fā)明"CL55"水稻中的 "CL55"乙酰乳酸合成酶基因序列。根據(jù)核苷酸編碼氨基酸的密碼子規(guī)律，推算獲得該乙酰 乳酸合成酶基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0022] 通過比對"CL55"水稻中如SEQ ID N0 :1所示的乙酰乳酸合成酶氨基酸序列和野 生型乙酰乳酸合成酶蛋白質(zhì)序列（如SEQ ID N0 :3所示），本發(fā)明的乙酰乳酸合成酶氨基 酸序列具有 4 個(gè)突變位點(diǎn)：AlallThr、Trp293Arg、Gln401Ala 和 Ser627Asn。
[0023] 實(shí)施例2.構(gòu)建含有"CL55"乙酰乳酸合成酶基因的農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化載體
[0024] 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T-DNA載體是基于pCambia 1300載體而構(gòu)建的。獲取表達(dá)乙酰乳酸 合成酶各個(gè)原件的步驟如下：
[0025] (1)獲得可用于構(gòu)建的"CL55"乙酰乳酸合成酶基因片段
[0026] "CL55"乙酰乳酸合成酶基因的核苷酸序列通過PCR從"CL55"的基因組中獲得，弓丨 物兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)：
[0027] AHASF-BamHl :5'GTGGGATCC atggctacgaccgccgcggccgcg，5'端被設(shè)計(jì)上 BamHI 位 占 .
[0028] AHASR-Sacl :5, GTGGAGCTC atacacagtcctgccatcaccatc，5' 端被設(shè)計(jì)上 SacI 位 點(diǎn)。
[0029] 將AHASF-BamHl和AHASR-Sacl擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后將純化后的產(chǎn)物 進(jìn)行BamHI和Sac 1雙酶切，獲得核苷酸片段AHAS55。
[0030] (2)獲得可用于構(gòu)建的終止子核苷酸片段
[0031] PEPC終止子（如SEQ ID N0 :5所示）從玉米的基因組中通過PCR獲得，使用的引 物分別是：
[0032] PEPCF-Sacl: 5'GTGGAGCTC aagagctcactggctaggcg，5' 端被設(shè)計(jì)上 SacI 位點(diǎn)；
[0033] PEPCF-Sacl: 5'GTGGGTACC ggtaccttaaacaagtccatc，5' 端被設(shè)計(jì)上 Kpnl 位點(diǎn)。
[0034] 將PEPCF-Sacl和PEPCF-Sacl擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后將純化后的產(chǎn)物 進(jìn)行SacI和Kpnl雙酶切，獲得核苷酸片段PEPC-Ter。
[0035] (3)獲得可用于構(gòu)建的啟動子
[0036] Ubiquitin-1啟動子（如SEQ ID N0 :6所示）從玉米的基因組中通過PCR獲得， 使用的引物分別是：
[0037] UbiF-Hind :5' GCGAAGCTTgcatgcctacagtgcagcgt，5' 端被設(shè)計(jì)上 Hindlll 位點(diǎn)）；
[0038] UbiR-BamH :5' GTGGGATCCgatgccccagatgatgtccac，5' 端被設(shè)計(jì)上 BamHI 位點(diǎn)）。
[0039] 將UbiF-Hind和UbiR-BamH擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后將純化后的產(chǎn)物進(jìn) 行Hindlll和BamHI雙酶切，獲得核苷酸片段Ubi-PMT。
[0040] 將上述乙酰乳酸合成酶表達(dá)原件進(jìn)行轉(zhuǎn)化T-DNA載體構(gòu)建：將pCambia 1300載 體進(jìn)行Hindlll和SacI雙酶切獲得核苷酸片段1300-HS，將1300-HS、Ubi-PMT和AHAS55 進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆菌株大腸桿菌TG1中，鑒定獲得質(zhì)粒1300-Ubi-AHAS55。將 質(zhì)粒1300-Ubi-AHAS55進(jìn)行SacI和Kpnl雙酶切獲得核苷酸片段1300-SK，將1300-SK和 PEPC-Ter進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入克隆菌株TG1中，鑒定獲得可用于農(nóng)桿菌植物轉(zhuǎn)化的 含有T-DNA載體的質(zhì)粒1300-CL55。
[0041] 實(shí)施例3.在野生型水稻品種中表達(dá)"CL55"的乙酰乳酸合成酶
[0042] 將質(zhì)粒1300-CL55轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4044中，以此農(nóng)桿菌進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基 因水稻的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)。選取成熟飽滿的秀水134種子去殼，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組 織作為轉(zhuǎn)化材料。取包含質(zhì)粒1300-CL55的農(nóng)桿菌劃板，挑單菌落接種準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿 菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入濃度為〇D 595 = 0 . 4的農(nóng)桿菌液中（含乙酰丁香酮），讓農(nóng)桿 菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到NBDC共培養(yǎng)基（含有50mg/ml的潮霉素） 中，共培養(yǎng)2-3天。用無菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到含抗生素的NBDS篩選培養(yǎng)基上，篩 選培養(yǎng)兩個(gè)月（中間繼代一次）。把篩選后，生長活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到MSH)預(yù)分化培養(yǎng) 基上培養(yǎng)20天左右，然后將預(yù)分化好的愈傷組織移到MSD分化培養(yǎng)基，14小時(shí)光照分化發(fā) 芽。2-3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上壯苗生根。最后，將再生植株洗去瓊脂 移植于溫室中，得到1300-CL55轉(zhuǎn)基因水稻植株，此植株作為鑒定材料。
[0043] 實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻的抗咪唑啉酮類除草劑分析
[0044] 在溫室中種植秀水134和轉(zhuǎn)基因1300-CL55水稻植株，每個(gè)除草劑處理秀水134 和轉(zhuǎn)基因1300-CL55水稻植株各30株，在水稻苗期噴灑咪唑煙乙酸或者甲咪唑煙酸除草 劑。
[0045] 其中，咪唑煙乙酸除草劑為山東先達(dá)公司的"豆說好"，稀釋濃度為稀釋200倍，終 濃度除草劑用量為500毫升。在噴灑除草劑10天后，觀察水稻植株的死亡率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參 見表1。
[0046] 其中，甲咪唑煙酸除草劑為德國巴斯夫公司的"百壟通"，稀釋濃度為稀釋1000 倍，終濃度除草劑用量為500毫升。在噴灑除草劑10天后，觀察水稻植株的死亡率，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果參見表1。
[0047] 由表1可知，噴灑除草劑10天后，野生型的秀水134植株全部死亡，而含有本發(fā)明 所述乙酰乳酸合成酶基因（轉(zhuǎn)基因T-DNA)的水稻植株全部存活。因此說明含有本發(fā)明如 SEQ IDN0 :1所示的乙酰乳酸合成酶的水稻植株具有抗咪唑啉酮類除草劑的特性。
[0048] 表 1
[0049]
[0050] 實(shí)施例5.在野生型玉米品種中表達(dá)"CL55"乙酰乳酸合成酶
[0051] 將質(zhì)粒1300-CL55轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4044中，以此農(nóng)桿菌進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基 因玉米的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)。取授粉后8-10天的Hi-2玉米穗，收集所有的未成熟 胚（大小為1. 0-1. 5_)作為轉(zhuǎn)化材料。取包含質(zhì)粒1300-CL55的農(nóng)桿菌劃板，挑單菌落接 種準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入濃度為〇D 595 = 0 . 4的農(nóng)桿菌液中（含乙酰 丁香酮），讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到無抗生素的NBDC共培養(yǎng) 基中，共培養(yǎng)10-14天。把愈傷組織繼續(xù)轉(zhuǎn)移到含抗生素的NBDC共培養(yǎng)基（含有50mg/ml 的潮霉素）中，共培養(yǎng)14-21天。轉(zhuǎn)移到含抗生素的NBDS篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)14-21 天。把篩選后，生長活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到MSH)預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-14天左右，然后 將預(yù)分化好的愈傷組織移到MSD分化培養(yǎng)基，14小時(shí)光照分化發(fā)芽。10-14天后，把抗性 再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上壯苗生根。最后，將再生植株洗去瓊脂移植于溫室中，得到 1300-CL55轉(zhuǎn)基因玉米植株，此植株作為鑒定材料。
[0052] 實(shí)施例6.轉(zhuǎn)基因玉米的抗咪唑啉酮類除草劑分析
[0053] 在溫室中種植Hi-2玉米和轉(zhuǎn)基因1300-CL55玉米植株，每個(gè)除草劑處理Hi-2玉 米和轉(zhuǎn)基因1300-CL55玉米植株各30株，在玉米苗期噴灑咪唑煙乙酸或者甲咪唑煙酸除草 劑。
[0054] 其中，咪唑煙乙酸除草劑為山東先達(dá)公司的"豆說好"，稀釋濃度為稀釋200倍，終 濃度除草劑用量為500毫升。在噴灑除草劑10天后，觀察玉米植株的死亡率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參 見表2。
[0055] 其中，甲咪唑煙酸除草劑為德國巴斯夫公司的"百壟通"，稀釋濃度為稀釋1000 倍，終濃度除草劑用量為500毫升。在噴灑除草劑10天后，觀察玉米植株的死亡率，實(shí)驗(yàn)結(jié) 果參見表2。
[0056] 由表2可知，噴灑除草劑10天后，野生型的Hi-2植株全部死亡，而含有如SEQ ID NO :1所示的乙酰乳酸合成酶基因（轉(zhuǎn)基因 T-DNA)的玉米植株全部存活。因此，可以說明 含有本發(fā)明如SEQ ID N0 :1所示的乙酰乳酸合成酶的玉米植株具有抗咪唑啉酮類除草劑的 特性。
[0057] 表 2
[0058]
[0059]
<110>上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 <120>-種使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸合成酶及其應(yīng)用 ^16〇>6 <210>SEQTDHO： 1 <2II>044 <212>PRT <213 > 水 frl ( ()/似沒麗） <400>1 Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Leu Ser Ala Ala 5 10 IS： Ala Thr Ala Ljs Thr Gly krg Lys Asn His Gin Arg His His Val 20 25 30 Leu Pro Aia Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser 35 40 45 Ala Val Ser Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr 50 55 60 Pro Leu Arg Pro Trp Gly P^o Ala： Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp 65 70 75 He Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe 80 85 9Q Ala Tyr Pro GLy Gly Ala Ser Met Glu lie His Gin Ala Leu Th：r 95 100 105 Arg Ser Pro Val He Thr Asn His Leu Ph? Arg: His Glu Gin Gly 110 115 120 Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val 125 130 135 Qlj Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro. Gly Ala Thr Aan Leu Val 14Q 145 150 Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro Met Val Ala 155 160 165 lie Thr Qly Gin ￥：al Pro Arg Arg Met He Gly Thr Asp Ala Phe 170 175 180 Gin： Glu Thr Pro He Val Glu Val Thr Arg Ser He Thr Lys His 185 190 195 Asn Tyr Leu ￥al Leu Asp Val Glti Asp lie Pro Arg ?al lie Gin 200 205 210 Glu Ala Phe Pho Leu： Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu 215 220 ￡25 Val Asp t ie Pro f,ys Asp Tie Girt Gin Gin Met Ala Val Pro Val
[0060] 230 235 240 Trp Asp Thr Ser Met Am： Leu Pm Gif Tyr lie Ala Arg Leu Pro 24.5 2.50 255 Lys Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gin Val Leu Arg Leu Val 2&) 265 270 Gly Glu Sor krg Arg Pro He Leu Tyr Val Glj Gly Gly Cys Ser 275 280 285 Ala Ser Gly Asp： Glu Leu Arg Arg; Phe Val Glu Leu Thr Gly lie 290 295 300 Pro Val Thr Thr Thr Leu Met Gly Lou Gly Asn Pho Pro Sor Asp 305 310 315 Asp Pro Leu Ser Leu Arg Met Leu (jIv Met His Gif Thr ￥al Tyr 320 '3；25 330 Ala Asn Tyr Ma Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Glj 340 Val Arg Phe Asp： Asp Arg： Val Thr Gly Lys He Glu Ala Phe Ala 350 355 360 Ser Arg Ala Lys He Val His lie Asp lie Asp Pro Ala Glu Tie 365 370 375 Gly Lys Asn Lys Gin Pro His ￥a.l Sor lie Cys Ala Asp Va 1 Lys 380 385 390 Lgu Ala Leu Gin Gly Leu As；n Ala Leu Leu Asp Gin Ser Thr Thr 395 400 4Q5 Lys thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His： Asn Glu Leu Asp Gin 410 415 420 Gin Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe Gly Glu Glu 4-25 430 435 lie Pro Pro Gin Tyr Ala lie Gin Val Leu A,sp Glu Thr Lys 440 446 450 Gly Glu Ala lie lie Ala Thr Gly ?al Gly Gin His： Gin Met Trp 455 4m 4B5 Ala Ala Gin Tjr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gin Trp Leu Ser 470 475 480 Ser Al芬 Gly Leu (Uy Ala Met Gly Phe Gly L即 Prt> Ala Ala; Ala 485 490 495 Gly Ala Ser Yal Ala A$n Pro Gly Val Thr Yal Vkl Asp lie Asp 500 505 510 Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn lie Gin Glu L^u Ala Leu He 515 520 525 Arg lie Glu Asn Lea Pro Val Lys Val Mot Val Leu Asn Asn Gin 5；5() 〇K) His Leu Gl5^ Met Val Val Gin Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Ljs Ala 545 550 555 真$n Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys G丄u Ser Glu 560 565 570
[0061] lie. Tyr Pro Asp Phe Yal Thr He Ala Lys Gly Phe Asn lie Pro： 575 oH{) Aia Val Arg Val Thr Lys Lys Ser Glu Val Arg A丄a Ala lie Lys 590 595 600 Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp lie lie Val 605 610 615 Pro： His Gin Glu His Val Leu Pro Met He Pro Asn Gly Gly Ala 620 625 630 Phe Lys Asp Met lie Leu Asp Gly Asp Gly Arg Thr Val Tyr 635 640 644 <2iO>SE〇 ID NO： 2 <21!>l〇35 <2I2>DNA <213 > tr i (()ryza saliva) <400>2
[0062]
<210>SF：〇 ID NO： 3 <211>644 <-212>PRT <213>水稻（似沒爾 <400>3 Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leii Ser Ala Ala 5 10 15 Ala Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gin Arg His His Val 20 2§ 3D Leu Pro Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Afg Gjs Ser 35 40 45 Ala Val Ser Pro Val Thr Pr〇 Pm Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr 50 55 60 Pro Leu Arg Pro Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp 65 70 75 lie Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe 80 85 90 Ala Tyiv I)rc> Gly Gly Ala Ser Met ?lu His GJjx Ala Leu Thr 95 100 105 Arg Ser Pro Val lie Thr Asn His Leu Phe Arg His Glu (iln (ily 110 115 120 Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr Ma Arg A1 Ei Ser Gly Arg Val 125 130 135 Gly Val Cys Val Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val 140 145 150 Ser Aia Leu Aia Asp A丄a Leu Leu Asp Ser Va_L Pro Met Vai A_La 155 160 165 lie Thr G_lv Gin Val Pro Arg Arg Met lie Gly Thr Asp Ala Phe 170 17:5 180 Gin Glu Thr Pro lie Val Glu Val Thr Arg Ser lie Thr Lrs His 185 190 195 Asn Tyr Leu Yal Leu Asp Val Glu Asp lie Pro Arg Val lie Gin 200 205 210 Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu 215 22Q 225
[0063] Val Asp lie Pro Lys Asp lie Gin Gin Gin Met Ala Val Pro Val 230 235 240 Trp Asp Tfar Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr lie: Ala 八rg Leti Pro 245 250 255 Lys Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gin Val Leu Arg Leu Val 260 265 270 Gly Glu Ser Arg Arg Pro He Leu Tyr Veil Gly Glj Gly Cys S.er 275 280 285 Ala Sot Gly A即 Glu Leu Arg Trp Phe Vtil Glu Leu Thr Gly lie 290 295 300 Pro Val Thr Thr Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp 305 310 315 Asp Pro L^u Ser Leu Arg Met Leu Gl> Met H丄s: &l'y Thr Yal Tyr 320 325 330 Ala Asn Tyr ALa Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly 335 34:0 345 Val Arg Phe A.sp Asp Arg Val Thr Gly Lys lie Glu Ala Pho Ala 350 355 360 Ser Arg Ala Lys: He Val His lie Asp lie Asp Pro Ala Glu lie 365 370 375 G：l；y Lys Asn Lys： Gin Pro His Yal Ser He Cys Ala Asp ￥al Lys 380 .385 390 Leu A_Lfi Leu Gin Gly Leu Asn Aia Leu Leu G丄n G_Ln Ser Thr Thr 395 400 405 Lys Thr Ser Ser Asp Phe S^：r Ala Trp His. Asn Glu L^：u Asp Gin 410 ，115 420 Gin Lys Arg Glu Phe Pro Leu Glj Tyr Lys Thr Phe Gly Glu Glu 425 430 435 lie Pro Pro Gin Tyr Ala lie Gin Val Leu Asp： Glu Leu Thr Lys UO 445 450 Gly Glu Ala lie He Ala Thr Gly Val Gly Gin Hjs Gin Met Trp 455 460 465 Ala Ala Gin Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gin Trp Leu Ser 470 475 480 Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Glj Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala 485 490 495 Gly Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp lie Asp 500 505 510 Gly Asp Gly Ser Phe Lew Met Asn lie Gin Glu Leu Ala Leix 515 520 Fi2〇 Arg lie： Gin Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gin 53:0 535 540 His Leu Gly Met Val Val Gin Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala 545 550 555 Asn Arg Al珥 His Thr Tyr Leu Giy Asn Pro G丄u Cys Glu Ser Glu
[0064] 5翻 585 570 lie Tyr Pro Asp Phe Yal Thr lie Ala Lys {Jlj Phe Ksn lie Pro 575 580 585 Ala Val Arg Val Thr Lys Lys： Ser Glu Val Arg Alfi Ala lie Lys 590 595 600 Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp lie lie Val 605 610 615 Pro His Gin Glu His Val Leu Pro Met lie Pro Ser GLy Gly Ala 620 625 630 Phe Lys Asp Met lie Leu Asp Gly Asp Gly Arg Thr Val Tyr 635 640 6:44 <2I(V、SF:Q IDM): 4 <211 '1935 <212>DNA <213 >水稻（0/:)ca ） <400>4
[0065]

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種使植物具有抗咪唑啉酮類除草劑特性的乙酰乳酸合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID No :1 所示。2. 如權(quán)利要求1所述的乙酰乳酸合成酶的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 不。3. 如權(quán)利要求1所述的乙酰乳酸合成酶在培育抗咪唑啉酮類除草劑植物中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述咪唑啉酮類除草劑為咪唑乙煙酸或 甲咪唑煙酸。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為水稻或玉米。
【文檔編號】C12N9/88GK105821026SQ201510005524
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月5日
【發(fā)明人】樸鐘澤, 方軍, 白建江, 楊瑞芳
【申請人】上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院