專利名稱：診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒其制備及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家畜血吸蟲病的診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及家畜血吸蟲病斑點金免疫滲濾診斷試劑盒及其制備方法與應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
家畜血吸蟲病既危害家畜健康，又是其病源的重要散播者。隨著我國血防工作的深入開展，雖已取得較大成績，但目前我國尚有100多個縣(市、區(qū))未能控制該病傳播，同時在已基本消滅家畜血吸蟲病的省、地區(qū)也仍有長期鞏固與監(jiān)測的任務(wù)。若采用常規(guī)糞孵血吸蟲毛蚴法檢測，需要投入較大的人力、物力和資金；現(xiàn)有的血清學(xué)診斷家畜血吸蟲病方法有IHA法、ELISA法，但其檢測時間長，單個樣品檢測需要0.5～3小時，而且這些方法中均含有潛在致癌物質(zhì)的酶顯色底物。要完成國務(wù)院提出的“到2015年底，力爭全國所有未控制血吸蟲病流行的縣(市、區(qū))達(dá)到血吸蟲病傳播控制標(biāo)準(zhǔn)”，急需有新的診斷技術(shù)支撐，因此尋找一種快速、簡便，適用于家畜血吸蟲病流行病學(xué)調(diào)查、普查、診斷、流通市場現(xiàn)場檢疫的方法，已成為防疫部門迫切希望解決的問題。
目前，在診斷人血吸蟲病的方法中尚有金標(biāo)法，丁建祖等浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所快速檢測日本血吸蟲抗體的金標(biāo)免疫滲濾法的建立及應(yīng)用 中國寄生蟲病防治雜志 1998 11(4)308；沈麗英等浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所 血吸蟲抗體金標(biāo)免疫診斷試劑盒的研制 中國公共衛(wèi)生2000 16(3)244；張素娥等 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所 金標(biāo)抗rSjc26GST多克隆抗體斑點免疫金滲濾法檢測血吸蟲循環(huán)抗原的研究 中國血吸蟲病防治雜志 2000 12(5)265；干小仙等 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病研究所 金標(biāo)滲濾法快速檢測血吸蟲循環(huán)抗原的現(xiàn)場應(yīng)用研究 中國人畜共患病雜志 2000 16(2)19該技術(shù)是將膠體金標(biāo)記在兔抗人IgG或者兔抗血吸蟲蟲卵多抗或者GST-PcAb上作為探針和顯色劑，將血吸蟲可溶性蟲卵抗原或血吸蟲重組蛋白多抗包被在硝酸纖維素膜上作為捕捉抗體，組成雙夾心DIGFA(金標(biāo)免疫滲濾法)。檢測時在測試盒的硝酸纖維素膜上滴加100μl待檢人血清，再用金標(biāo)探針顯色的一種免疫學(xué)檢測方法。該法存在的主要問題是需要制備血吸蟲重組蛋白多抗或者兔抗人IgG或者兔抗血吸蟲蟲卵多抗或者GST-PcAb，制備這些專一多抗周期長，手續(xù)繁雜，成本很高，限制了它們在普查家畜血吸蟲病中推廣應(yīng)用。而且在制備膠體金標(biāo)記的探針時，通常以試管目測法確定多抗的用量，為了保證充分包被，避免多余膠體金與非特異蛋白結(jié)合而干擾檢測結(jié)果判斷，一般在此基礎(chǔ)上再增加10％～20％的多抗的用量，然后又為了去除多余的游離多抗，又需要進(jìn)行層析或高速離心等純化處理，這些處理或者對設(shè)備條件要求很高，或者處理過程周期長，步驟繁雜，因此成本均高，不利于產(chǎn)業(yè)化開發(fā)；三是由于該法以捕捉多抗為固相，以待測血清和膠體金探針為流動相，所以一塊反應(yīng)盒僅能檢測1個人的血樣，其檢測成本較高而效率較低；同時其含有包被抗原或多抗的硝酸纖維素膜的測試盒需在4～8℃的條件下貯藏，對大面積推廣應(yīng)用增加了難度；四是反應(yīng)步驟多，帶來的干擾也相對增多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述不足之處，提供一種敏感、特異、結(jié)果可靠、成本低廉、檢測效率較高的家畜血吸蟲病診斷試劑盒；本發(fā)明的另一目的是提供該試劑盒中血吸蟲抗原膠體金的簡便、省本、省時的制備方法；本發(fā)明的第三個目的是提供一套應(yīng)用該試劑盒對家畜血吸蟲病進(jìn)行簡便，快速，準(zhǔn)確的診斷方法。
本發(fā)明斑點金免疫滲濾法的基本原理是一種采用硝酸纖維素膜為家畜待檢血樣的固相載體，以親和層析原理為基礎(chǔ)，抗原膠體金結(jié)合物為液相，并同時作為探針和指示劑，而建立起來的一種新型的免疫檢測方法。其中膠體金顆粒的表面帶負(fù)電荷與血吸蟲抗原蛋白分子的正電荷基團(tuán)因靜電作用形成牢固的結(jié)合，同時金顆粒又有高電子密度的特性，當(dāng)這些被標(biāo)記的抗原與相應(yīng)的抗體配體大量聚集時，便形成肉眼可見的紅色斑點。
本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)的。
一種診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒，包括盒體、內(nèi)置反應(yīng)盒、黑色試劑瓶、生理鹽水瓶(內(nèi)裝有0.85％生理鹽水)及玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑1mm)及標(biāo)準(zhǔn)陽性血紙、陰性血紙；其中所述反應(yīng)盒由盒底、盒蓋組成的塑料小盒，盒蓋中央有一直徑0.8cm的小圓孔，盒內(nèi)裝滿吸水墊料，緊貼盒蓋小圓孔內(nèi)放一層1.1×1.1cm硝酸纖維素膜(孔徑為0.45μ或0.65μ)，緊閉盒蓋即成反應(yīng)盒；所述黑色試劑瓶內(nèi)裝有血吸蟲抗原膠體金。
一種制備上述診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒的方法，所述盒體、黑色試劑瓶、生理鹽水瓶及玻璃毛細(xì)管均為常規(guī)實驗用品；所述黑色試劑瓶內(nèi)裝有的血吸蟲抗原膠體金按以下原料比例與工藝步驟制備而成(1)、膠體金的制備 膠體金以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3及雙蒸水為原料，先將1％氯金酸與雙蒸水按體積比1∶79配成A液；再將1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3與雙蒸水按體積比4∶0.03～0.15∶0.03～0.15∶15.70～15.94配成B液；將配制好的A液、B液在水浴內(nèi)同時加熱到59～61℃，在電磁攪拌器上攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌1分鐘，在10～13分鐘內(nèi)加熱至沸騰，氯金酸在鞣酸-檸檬酸鈉還原劑的作用下，使金離子還原成金原子，其液體顏色由黑→藍(lán)→紫→紅色，此時合成的膠體金顆粒直徑R＝8～12nm，較穩(wěn)定，在4℃下可保存13個月。
(2)血吸蟲可溶性抗原與純化抗原的制備 將日本血吸蟲卵置玻璃研磨器中研磨后，用0.85％NaCl溶液按重量配成5％濃度溶液，置-25℃反復(fù)凍融7次，用40KHz、400W超聲波探頭浸入溶液內(nèi)處理20分鐘，在4℃下以13000rpm離心60分鐘，吸取上清液為血吸蟲可溶性抗原；將可溶性抗原經(jīng)葡聚糖凝膠G200分離純化，將其中有活性的第I峰與II峰合并作為血吸蟲純化抗原；再將該可溶性抗原及純化抗原分別裝入透析袋，用雙蒸水進(jìn)行透析去除鹽分后，即成合格的包被用的血吸蟲可溶性抗原與血吸蟲純化抗原。
(3)膠體金pH值的調(diào)整 膠體金與血吸蟲抗原的結(jié)合在等電點的條件下最穩(wěn)定，因此，膠體金液在被血吸蟲抗原包被前，需用0.25MK2CO3調(diào)整膠體金液的pH值為7.15～7.2，才能使膠體金與血吸蟲抗原牢固地結(jié)合。
(4)血吸蟲抗原包被膠體金 按體積重量比每100ml膠體金液與血吸蟲可溶性抗原1.16～1.52mg或與血吸蟲純化抗原0.58～0.76mg混合進(jìn)行包被，攪拌10分鐘后，依次加入適量的10％疊氮鈉、10％牛血清白蛋白和10％聚乙二醇，攪勻后1500rpm/min離心30分鐘，吸收紅色上清液，即成血吸蟲抗原膠體金，并按量分裝于黑色試劑瓶內(nèi)封口，保存。
上述血吸蟲抗原膠體金制備方法的一種優(yōu)選方案是，其中所述配制膠體金的B液的組分與含量為1％檸檬酸三鈉4.0ml、1％鞣酸0.09ml、25mMK2CO30.09ml、雙蒸水15.82ml；制成的膠體金顆粒直徑為10＜D≤11nm；膠體金液pH值調(diào)為7.20；包被膠體金液的抗原采用血吸蟲可溶性抗原，膠體金液與抗原的體積重量比為100ml∶1.30mg。
一種應(yīng)用上述診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒診斷家畜血吸蟲病的方法，具體是按以下步驟操作(1)待檢家畜干燥血紙血樣的采取 采取動物耳靜脈血2～5滴/頭，滴于紙面，陰涼干燥，備用；(2)干燥血紙血樣浸出液的提取 裁取含血樣部位干燥血紙，按每0.24cm2加0.5毫升0.85％生理鹽水比例在容器內(nèi)浸泡，每5分鐘搖動1次，浸泡15～20分鐘后即成血樣浸出液；(3)血樣浸出液點樣 用內(nèi)徑1mm玻璃毛細(xì)管吸取上述血樣浸出液1μl，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜面上，每膜可點一至四份的待檢血樣；(4)滴加血吸蟲抗原膠體金 反應(yīng)盒點血樣后室溫下放置40～90秒鐘，再往其硝酸纖維素膜上滴加2～3滴約100～150μl血吸蟲抗原膠體金；(5)觀察并記錄結(jié)果 觀察反應(yīng)盒若點樣處出現(xiàn)紅色斑點即為陽性，否則為陰性。
本發(fā)明的有益效果一是本發(fā)明金標(biāo)免疫滲濾法檢測血吸蟲病抗體僅需2步操作，比夾心雙抗金標(biāo)免疫滲濾法的6～7個操作步驟減少4～5步，同時也省去了抗抗體或多克隆抗體的制備，節(jié)約了成本；二是本發(fā)明是在探明了日本血吸蟲抗原包被膠體金的最適穩(wěn)定量及膠體金標(biāo)記血吸蟲抗原最佳pH值的基礎(chǔ)上，將該抗原與膠體金直接結(jié)合成抗原膠體金，因無游離的抗原，故結(jié)合后不需要濃縮、層析純化或高速離心純化等繁雜處理，比多抗膠體金降低生產(chǎn)成本70％以上，工效提高50倍以上，制作工藝簡單，省工、省時、節(jié)省成本，有利于產(chǎn)業(yè)化開發(fā)；三是該抗原膠體金具有多功能的特性，可直接應(yīng)用于牛、羊、豬，兔等各種家畜血吸蟲病抗體的檢測，克服了常規(guī)金標(biāo)法檢測不同種屬動物疾病需制備各自專一的金標(biāo)抗抗體，使用受局限，成本高等缺點；四是該抗原膠體金能檢測出自然感染1對血吸蟲的病?？贵w，能檢測出人工感染7～42天的血吸蟲病畜抗體，與糞孵血吸蟲毛蚴法陽性符合率達(dá)100％，陰性符合率達(dá)98.7％，具有敏感、特異、檢出率高等特點；同時該診斷試劑在4℃下保存12個月，對30份陽性及30份陰性血紙每星期檢測一次，每次結(jié)果一致，表明該診斷試劑穩(wěn)定性及重現(xiàn)性均好；五是本發(fā)明檢測方法以血紙?zhí)娲Ｒ?guī)血清樣品，解決了農(nóng)村基層制備血清采血量大，并需離心設(shè)備進(jìn)行分離加工，血清的輸送與貯藏還需冷藏等諸多難題；該方法操作簡單，顯色快速，將待檢血紙浸出液1μl點在硝酸纖維素膜上作為固相，一個反應(yīng)盒最多可點4份血樣而互不干擾，然后僅需點3滴(150μl)血吸蟲抗原膠體金作為流動相，其抗原與特異抗體在數(shù)秒鐘即能結(jié)合，檢測過程不到2分鐘就能完成，在反應(yīng)處發(fā)生抗原抗體金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點即為陽性，陰性則僅留白色背景，該結(jié)果判斷容易，并可長期保存，以利于回顧性分析和研究，因此與診斷人血吸蟲病的金標(biāo)法相比其檢測工效提高了數(shù)倍也顯著降低了成本；六是這種以紅色膠體金標(biāo)記血吸蟲抗原來檢測待檢血樣，可省去酶標(biāo)法加底物顯色的步驟，也沒有潛在致癌物質(zhì)酶顯色底物的危害。
具體實施例方式
本發(fā)明通過以下實施例和試驗例作進(jìn)一步具體描述。
實施例1(診斷試劑盒)包括盒體、內(nèi)置反應(yīng)盒、黑色試劑瓶、生理鹽水瓶(內(nèi)裝有0.85％生理鹽水)和點血樣用的玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑1mm)及標(biāo)準(zhǔn)陽性血紙、陰性血紙，提供該兩紙目的，一是供使用人檢查所用的血吸蟲抗原膠體金是否有效，二是為使用者提供判別陰性反應(yīng)和陽性反應(yīng)的參考標(biāo)準(zhǔn)；其中，反應(yīng)盒為3cm×2.5cm×0.6cm的塑料小盒，分盒底和盒蓋兩部分，盒蓋中央有一個0.8cm的小圓孔，盒內(nèi)墊滿吸水材料，在小圓孔下和吸水材料之上放置一層1.1×1.1cm的硝酸纖維素膜(孔徑為0.45μ或0.65μ)，合緊盒蓋即組成反應(yīng)盒；在黑色試劑瓶內(nèi)裝有血吸蟲抗原膠體金。
實施例2(膠體金的制備方法1)本發(fā)明以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mMK2CO3與雙蒸水為原料，采用鞣酸-檸檬酸鈉還原法制備膠體金。檸檬酸鈉主要為還原劑，而鞣酸具有還原和保護(hù)的雙重作用，控制“晶核”的形成過程。鞣酸用量多少決定膠體金粒徑形成的大小，因此改變鞣酸的用量，可達(dá)到制備所需直徑顆粒的膠體金之目的。本例A液，B液各原料組分的配比見表1表1A液、B液的配制(單位ml)

將配制好的A液、B液在水浴內(nèi)同時加熱到59～61℃，在電磁攪拌器上攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌1分鐘，在10～13分鐘內(nèi)加熱至沸騰，氯金酸在鞣酸-檸檬酸鈉還原劑的作用下，使金離子還原成金原子，其膠體金液顏色由黑→藍(lán)→紫→紅色，此時合成的膠體金顆粒直徑為11＜D≤12nm，較穩(wěn)定，在4℃下可保存13個月。
實施例3(膠體金的制備方法2)表2A液、B液的配制(單位ml)

A液與B液的配制與合成方法同實施例1，制成的膠體金顆粒直徑為10＜D≤11nm。
實施例4(膠體金的制備方法3)
表3A液、B液的配制(單位ml)

A液與B液的配制與合成方法同實施例1，制成的膠體金顆粒直徑為8＜D≤10nm。
實施例5(血吸蟲可溶性抗原與血吸蟲純化抗原的制備方法)將日本血吸蟲卵置玻璃研磨器中研磨后，用0.85％NaCl溶液按重量比配成5％溶液，置-25℃反復(fù)凍融7次，用40KHz、400W超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進(jìn)行超聲波處理20分鐘，在4℃下以13000rpm離心60min，吸取上清液即為血吸蟲可溶性抗原；將該血吸蟲可溶性抗原經(jīng)葡聚糖凝膠G200分離純化，用0.01M磷酸鹽緩沖液pH7.0洗脫，流速為14ml/hr，以3ml/管收集洗脫液，洗脫液在280nm下測A值，將有活性的第I峰與II峰合并即為血吸蟲純化抗原；將上述可溶性抗原和純化抗原各自裝入透析袋，用雙蒸水進(jìn)行透析去除鹽分，即得包被膠體金用的血吸蟲抗原，透析去除鹽分的目的是防止膠體金聚沉和干擾膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合。
實施例6(血吸蟲抗原包被膠體金最適穩(wěn)定量的測定)在血吸蟲抗原包被膠體金之前，必須做好膠體金與血吸蟲抗原用量比例的測定，以達(dá)到標(biāo)記時采用最小抗原用量來實現(xiàn)與膠體金的充分結(jié)合，不僅可以節(jié)省抗原的用量，而且在包被后的抗原膠體金中沒有游離的抗原蛋白質(zhì)，因而可簡化離心純化的步驟；具體采用目測法，取6支試管，每一試管中加入實施例2、3或4所制1ml膠體金，每管中再加入不同量的由實施例5所制抗原，按表4、5所示進(jìn)行。
表4 膠體金與血吸蟲可溶性抗原用量比例的測定

表5膠體金與純化抗原用量比例的測定

未加抗原由紅色變藍(lán)色，加入抗原量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，由紅色變紫藍(lán)色或紫紅色；而加入抗原達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅色不變，如表4中的第3管，表5中的第4管即為穩(wěn)定1ml膠體金所需的抗原用量。
實施例7(血吸蟲抗原膠體金的制備方法1)取實施例2所制膠體金液100ml，在電磁攪拌下用25mM K2CO3調(diào)pH值為7.15，然后逐滴加入實施例5所制血吸蟲可溶性抗原1.16mg或純化抗原0.58mg，繼續(xù)攪拌10分鐘后，依次加入10％疊氮鈉96μl、10％牛血清白蛋白10μl、10％聚乙二醇30μl，攪勻后，1500rpm/min離心30分鐘，吸出上清紅色液體，則為血吸蟲抗原膠體金產(chǎn)品，按包裝規(guī)格10ml/瓶或20ml/瓶分裝于黑色聚乙烯瓶內(nèi)封口，置4～8℃保存。
實施例8(血吸蟲抗原膠體金的制備方法2)取實施例3所制膠體金液100ml，在電磁攪拌下將膠體金用25mM K2CO3調(diào)pH值為7.20，然后逐滴加入實施例5所制血吸蟲可溶性抗原1.30mg或純化抗原0.67mg，其余步驟同實施例7。
實施例9(血吸蟲抗原膠體金的制備方法3)取實施例4所制膠體金液100ml，在電磁攪拌下將膠體金用25mM K2CO3調(diào)pH值為7.25，然后逐滴加入實施例5所制血吸蟲可溶性抗原1.52mg或血吸蟲純化抗原0.76mg，其余步驟同實施例7。
實施例10(家畜血吸蟲病斑點金免疫滲濾檢測方法)按以下具體步驟操作(1)待檢家畜干燥血紙血樣的采取 采取動物耳靜脈血2～5滴/頭，滴于新華濾紙上，陰涼處干燥，備用。
(2)以打孔器裁取干燥血紙圓片(0.24cm2)1片，投入已編號的清潔、干燥試管或青霉素瓶內(nèi)，加入0.5毫升生理鹽水(0.85％NaCl)浸泡，每隔5分鐘搖動1次，15～20分鐘后，則為血紙浸出液備用。
(3)取塑料反應(yīng)盒，用記號筆在圓孔外四周按順時針編上相應(yīng)血樣號。
(4)用內(nèi)徑1mm玻璃毛細(xì)管吸取血紙浸出液，將玻璃毛細(xì)管輕貼硝酸纖維素膜點樣1μl左右(每個樣品用一根毛細(xì)管，不能混用)，若1個血樣，將血樣點在塑料反應(yīng)盒硝酸纖維素膜中央；若2～4個血樣，則沿距小圓孔邊緣1mm左右按順時針點樣。
(5)點好樣品后，反應(yīng)盒室溫放置40～90秒鐘。
(6)加實施例7、8或9所制血吸蟲抗原膠體金2～3滴(約100～150μl)；(7)觀察并記錄結(jié)果 在硝酸纖維素膜上點血樣處出現(xiàn)紅色斑點為陽性，否則為陰性。
試驗例說明(1)供試血紙樣品i血吸蟲病牛血紙(湖北、四川)，經(jīng)糞孵法查見有血吸蟲毛蚴的牛采血，制備血紙。
ii自然感染血吸蟲病牛血紙(湖南)，經(jīng)解剖沖蟲法收集到自然感染1對血吸蟲蟲體的牛采血，制備血紙。
iii健康牛血紙來自浙江、黑龍江、吉林、山東屠宰場，經(jīng)糞孵法未見血吸蟲毛蚴，采血，制備血紙。
iv人工感染血吸蟲病牛血紙 人工感染血吸蟲尾蚴50～500條的牛，在感染后3、5、7、14、21、28、35、42天時采血，制備血紙。
v人工感染血吸蟲病兔血紙及血清 人工感染血吸蟲尾蚴20～800條的兔，在感染后7天、14天、21天、28天、35天、41天、80天的兔采血，制備血紙及血清。
vi健康牛血紙、人工及自然感染血吸蟲的牛血紙、自然感染肝片吸蟲的牛血紙、人工感染肝片吸蟲羊血紙、人工感染錐蟲的羊血紙、人工感染蛔蟲的豬血紙、自然感染囊蟲的豬血紙。
(2)測定試劑，裝置與方法試劑盒 見實施例1；血吸蟲抗原膠體金 按實施例7、8或9制備；血吸蟲抗原膠體金檢測方法 按實施例10方法；兔抗血吸蟲卵可溶性 由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院寄生蟲病抗原多抗膠體金 研究所提供；兔抗血吸蟲卵可溶性抗原多抗膠體金檢測方法 按試劑盒中所附說明書斑點酶標(biāo)法試劑 由浙江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)所提供斑點酶標(biāo)法檢測方法 浙江畜牧獸醫(yī)，1993 18卷第4期試驗例1(斑點金滲濾法與糞孵血吸蟲毛蚴法陽性符合率對比)本發(fā)明斑點金滲濾法與糞孵血吸蟲毛蚴法陽性、陰性符合率對比


注以本發(fā)明的斑點金滲濾法與糞孵血吸蟲毛蚴法分別檢測139頭血吸蟲病陽性牛血紙，陽性符合率為100％；檢測130頭血吸蟲病陰性牛的血紙，陰性符合率99.2％。
試驗例2(斑點金滲濾法與斑點酶標(biāo)法陽性、陰性符合率對比)斑點金滲濾法與斑點酶標(biāo)法陽性、陰性符合率對比

注以本發(fā)明斑點金滲濾法和斑點酶標(biāo)法分別檢測139頭血吸蟲陽性牛和130頭血吸蟲陰性牛的血紙，陽性符合率和陰性符合率兩者均相同。
試驗例3(對人工感染血吸蟲病牛不同感染期血紙的檢測)斑點金免疫滲濾法測定人工感染不同時間血吸蟲病牛血紙的反應(yīng)

注不顯色或淡黃色判為“-”，淡桔黃色判為“±”，淡桔紅色判為“+”，依紅色由淺到深分別判為“++”、“+++”和“++++”，“++”以上判為陽性。
人工感染血吸蟲尾蚴50～500條的牛5頭，在感染后3、5、7、14、21、28、35、42天分別采血，制備血紙，按實施例10介紹的血紙檢測方法進(jìn)行檢測；結(jié)果，人工感染血吸蟲7～42天的病牛血樣均出現(xiàn)紅色斑點，而人工感染前及人工感染3、5天的血樣均不顯示紅色斑點。
試驗例4(不同人員同法操作試驗)斑點金免疫滲濾法檢測自然感染血吸蟲病牛血紙的可重復(fù)性檢驗

由湖北和四川糞孵毛蚴陽性牛的血紙樣品中分別隨機抽取12份和8份，由浙江、黑龍江、吉林、山東糞孵毛蚴陰性牛的血紙中分別隨機取7份、5份、11份和6份，共49個樣品，由5個操作人員按照實施例10的方法分別操作檢測，陽性和陰性的判別結(jié)果5人一致。
試驗例5(對羊、豬和兔陽性血紙符合率和陰性血紙符合率的檢測)病羊血紙樣品2個，豬血紙樣品5個，兔血紙樣品5個(均系人工感染血吸蟲)，以及健康羊、豬、兔血紙樣品各5個，以實施例10的方法進(jìn)行檢測，陽性血紙符合率和陰性血紙符合率均為100％。
試驗例6(血吸蟲抗原膠體金保存期試驗)血吸蟲抗原膠體金保存期測定

注血吸蟲抗原膠體金系按實施例7、8或9方法制備。
試驗結(jié)果在4～8℃下保存12個月仍有效，在室溫下可保存3個月之久。
試驗例7(家畜血吸蟲病斑點金滲濾法的特異性試驗)以本發(fā)明家畜血吸蟲病斑點金滲濾法試劑盒分別檢測健康牛血紙、人工及自然感染血吸蟲的牛血紙、自然感染肝片吸蟲的牛血紙、人工感染肝片吸蟲羊血紙、人工感染錐蟲的羊血紙、人工感染蛔蟲的豬血紙、自然感染囊蟲的豬血紙。其反應(yīng)見下表。
家畜血吸蟲病斑點金免疫滲濾法試劑盒的特異性檢測

檢測結(jié)果表明，血吸蟲抗原膠體金僅對血吸蟲病牛血紙呈陽性斑點反應(yīng)，對健康牛血紙、人工及自然感染肝片吸蟲病牛與病羊血紙、人工感染錐蟲病羊血紙、人工感染蛔蟲病豬血紙、自然感染囊蟲病豬血紙均未出現(xiàn)紅色斑點，證實上述5種寄生蟲病之間無交叉反應(yīng)現(xiàn)象，說明該診斷試劑有較強的特異性。
試驗例8(本發(fā)明血吸蟲抗原膠體金與兔抗血吸蟲卵可溶性抗原多抗膠體金的比較)用本發(fā)明試劑盒和兔抗血吸蟲卵可溶性抗原多抗膠體金試劑盒(雙夾心DIGFA法)分別對人工感染血吸蟲尾蚴20～500條的0天、7天、14天、21天、28天、35天、41天和80天兔血清進(jìn)行檢測，應(yīng)用本發(fā)明試劑盒對血清作50～300倍稀釋點樣僅需1μl，而兔抗血吸蟲卵可溶性抗原多抗膠體金試劑盒使用的血清不稀釋，每次用量為100μl。結(jié)果見下表血吸蟲抗原膠體金與兔抗血吸蟲卵可溶性抗原多抗膠體金檢測血吸蟲病兔抗體的靈敏度比較

檢測結(jié)果表明，用本發(fā)明的血吸蟲抗原膠體金試劑盒可以檢測出人工感染血吸蟲7～80天的病兔抗體，而兔抗血吸蟲卵可溶性抗原多抗膠體金試劑盒只能檢測出人工感染血吸蟲28～80天的病兔抗體，而且每次測定所需的血清數(shù)量較多。所以本發(fā)明試劑盒的檢測敏感度比雙夾心DIGFA法試劑盒高，可提早21天測出血吸蟲病兔抗體。
同時，應(yīng)用本發(fā)明能測出自然感染僅1對血吸蟲病牛的血紙抗體，證實斑點金滲濾法具有很高的敏感性。
權(quán)利要求
1.診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒，包括盒體、內(nèi)置反應(yīng)盒，黑色試劑瓶、生理鹽水瓶、玻璃毛細(xì)管及標(biāo)準(zhǔn)陽性血紙、陰性血紙，其特征是所述反應(yīng)盒由盒底、盒蓋組成的塑料小盒，盒蓋中央有一直徑0.8cm圓孔，盒內(nèi)裝滿吸水墊料、緊貼盒蓋圓孔內(nèi)放一層1.1×1.1cm硝酸纖維素膜，緊閉盒蓋即成反應(yīng)盒；所述黑色試劑瓶內(nèi)裝有血吸蟲抗原膠體金。
2.一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其中盒體、黑色試劑瓶、生理鹽水瓶及玻璃毛細(xì)管均為常規(guī)實驗用品；其特征是所述血吸蟲抗原膠體金按以下工藝步驟制備而成(1)膠體金的制備 以1％氯金酸、1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mM K2CO3及雙蒸水為原料，先將1％氯金酸與雙蒸水按體積比1∶79配成A液；將1％檸檬酸三鈉、1％鞣酸、25mM K2CO3與雙蒸水按體積比4∶0.03～0.15∶0.03～0.15∶15.70～15.94配成B液；再將A液、B液在水浴內(nèi)同時加熱到59～61℃，攪拌A液，快速加入B液，繼續(xù)攪拌1分鐘，在10～13分鐘內(nèi)加熱至沸騰，制成顆粒直徑D＝8～12nm的膠體金，該膠體金液顏色由黑→藍(lán)→紫→紅色時即成；(2)血吸蟲可溶性抗原與純化抗原的制備 將日本血吸蟲卵研磨后，用0.85％NaCl溶液按重量配成5％溶液，置-25℃反復(fù)凍融7次，用超聲波處理該液20分鐘后，在4℃下以13000rpm離心60分鐘，吸取上清液為血吸蟲可溶性抗原；該可溶性抗原經(jīng)層析分離純化得血吸蟲純化抗原；再將該兩種抗原分別用雙蒸水進(jìn)行透析去除鹽分后，即成血吸蟲可溶性抗原與血吸蟲純化抗原；(3)膠體金pH值的調(diào)整 將步驟(1)膠體金液在包被前用0.25M K2CO3調(diào)整pH值為7.15～7.25；(4)血吸蟲抗原包被膠體金 按體積重量比將步驟(3)膠體金液100ml與血吸蟲可溶性抗原1.16～1.52mg或與血吸蟲純化抗原0.58～0.76mg混合進(jìn)行包被，攪拌10分鐘后，依次加入10％疊氮鈉96μl、10％牛血清白蛋白10μl、10％聚乙二醇30μl，攪勻后1500rpm/min離心30分鐘，吸收紅色上清液，即成血吸蟲抗原膠體金，并按量分裝于黑色試劑瓶內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，其中所述配制膠體金的B液的組分與含量為1％檸檬酸三鈉4.0ml、1％鞣酸0.09ml、25mM K2CO30.09ml與雙蒸水15.82ml；制成的膠體金顆粒直徑為10＜D≤11nm；膠體金液pH值調(diào)為7.20；包被膠體金液的抗原采用血吸蟲可溶性抗原，膠體金液與抗原的體積重量比為100ml∶1.30mg。
4.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述試劑盒診斷家畜血吸蟲病的方法，其特征是按以下步驟操作(1)待檢家畜干燥血紙血樣的采取 采取動物耳靜脈血2～5滴/頭，滴于紙面，涼干，備用；(2)干燥血紙血樣浸出液的提取 裁取干燥血紙，按每0.24cm2加0.5毫升生理鹽水比例在容器內(nèi)浸泡，每5分鐘搖動1次，浸泡15～20分鐘后即成血樣浸出液；(3)血樣浸出液點樣 用內(nèi)徑1mm玻璃毛細(xì)管吸取步驟(2)血樣浸出液1μl，點在反應(yīng)盒圓孔內(nèi)硝酸纖維素膜上，每膜可點一至四份待檢血樣；(4)滴加血吸蟲抗原膠體金 步驟(3)反應(yīng)盒點血樣后室溫下放置40～90秒鐘，再往其硝酸纖維素膜上滴加2～3滴，約100～150μl血吸蟲抗原膠體金；(5)觀察并記錄結(jié)果 步驟(4)反應(yīng)盒點樣處顯紅色斑點即為陽性，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種診斷家畜血吸蟲病斑點金滲濾試劑盒其制備及應(yīng)用方法，屬新型的免疫標(biāo)記技術(shù)和家畜血吸蟲病免疫學(xué)診斷技術(shù)。本發(fā)明將膠體金直接標(biāo)記在日本血吸蟲抗原蛋白質(zhì)上，適用于牛、羊、豬、兔等多種動物血吸蟲病抗體的檢測；在應(yīng)用時僅需將被檢家畜血樣干紙浸出液，點在硝酸纖維素膜上作為固定相，再滴加血吸蟲抗原膠體金2～3滴(100～150μl)，2分鐘內(nèi)即形成肉眼可見的紅色斑點，結(jié)果判斷容易，一個反應(yīng)盒可做4份待檢血樣，降低了檢測成本，提高了效率，具有敏感、特異、檢出率高，省工、省時、成本低等優(yōu)點。與糞孵血吸蟲毛蚴法相比，陽性符合率達(dá)100％，陰性符合率99.2％。
文檔編號G01N33/569GK1700008SQ200510050188
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月21日
發(fā)明者張雪娟, 盧福莊, 方蘭勇, 馮尚連, 項美華, 程菊芬, 周永學(xué) 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院