光交聯(lián)的透明質(zhì)酸衍生物及其制備方法和應用
【專利說明】光交聯(lián)的透明質(zhì)酸衍生物及其制備方法和應用
[0001] 發(fā)明概沐
[0002] 本發(fā)明公開了光交聯(lián)的透明質(zhì)酸（HA)衍生物，其由HA、作為三甘醇的雙功能聚乙 二醇（PEG)間隔基以及選自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反應性化合物構成。 技術背景
[0003] 水凝膠和海綿是特征為三維結構的聚合物網(wǎng)絡，對水凝膠而言其是緊密的，對海 綿而言其具有相互連接的孔。海綿通常吸收大量的水，而在水凝膠中該特性（"膨脹"）可 能較不顯著，其取決于水凝膠的緊密度；非常緊密的凝膠比不非常緊密的凝膠吸附的水少。
[0004] 已經(jīng)對這些類型的材料進行了一段時間的研宄；例如，水凝膠用于以下領域：藥 物遞送、軟組織填充和關節(jié)障礙，所述關節(jié)障礙受益于向關節(jié)插入吸收張力和振動的"支 承（bearings)"。海綿特別用于組織工程學領域，尤其是它們被細胞建群的能力。這 些應用明顯完全取決于所使用的起始聚合物的性質(zhì)。具體而言，在本發(fā)明的情況中，選 擇的聚合物是多糖、即透明質(zhì)酸（HA)，一種由交替的D-葡糖醛酸和N-乙?；?D-葡 糖胺殘基構成的雜多糖。其是分子量至多13x 106Da的直鏈聚合物，這取決于其獲得 的來源和所使用的制備方法。其普遍存在，且在生物有機體中起重要作用，尤其作為 許多組織、諸如皮膚、腱、肌肉和軟骨的細胞的機械支撐。其還調(diào)節(jié)許多涉及細胞生理 學和生物學的不同的過程、諸如細胞增殖、迀移和分化和血管發(fā)生（Weigel P.等人，J Theoretical Biol，1986:219_234;Abatangelo G.等人，J Surg Res, 1983, 35:410-416; Goa K.等人，Drugs, 1994, 47:536-566)，且還履行其它功能、諸如組織水合和關節(jié) 潤滑。在關節(jié)中，關節(jié)液中包含的透明質(zhì)酸在緩慢移動期間用作粘性潤滑劑，在快 速移動期間，由于其彈性特性，其吸收任何影響關節(jié)的損傷或微傷（Balazs EA.等 人，J Rheumatol Suppl, 1993, 12:75-82 ;Belcher C.等人，Annals of the Rheumatic Diseases, 1997, 56:299-307)。這些受到廣泛認可的性質(zhì)的組合在各種來源的傷口、潰瘍和 皮膚損害的治療所用的敷料的制備中和在設計用于骨關節(jié)炎、軟骨退化等的治療中的關節(jié) 內(nèi)應用的醫(yī)療裝置中已經(jīng)使用了一段時間。
[0005] 使用眾多方法從多種多糖來獲得具有特定特性的水凝膠；對透明質(zhì)酸成功使用的 最重要的方法包括化學交聯(lián)（使用與給定官能團特異性反應的分子（二乙烯基砜，BDDE))， 或游離基聚合。這些方法，其先決條件為對HA化學修飾以使它們適合之后的交聯(lián)或聚合 (衍生）反應，得到具有良好特性（緊密度、化學和機械耐力和水合能力）的水凝膠；然而， 由于衍生和交聯(lián)同時發(fā)生，所以在凝膠的形成過程中，能將試劑殘余物保留在它們的結構 中，且試劑殘余物特別經(jīng)常是有毒的，因為它們難以除去。
[0006] 獲得聚合物交聯(lián)形成的另一個系統(tǒng)是對之前用適合的官能團衍生過的多糖使用 UV輻照以賦予它們光反應性。衍生涉及：鍵合于多糖物質(zhì)，當所述多糖物質(zhì)通過UV輻照被 活化時它們鍵合在一起，使不同的聚合物鏈交聯(lián)，并由此生成網(wǎng)絡。所述方法特別有利，因 為在衍生步驟期間其能容易有效地去除不期望的反應殘留或中間體，并因此有助于更安全 地制備終產(chǎn)物?？梢允褂枚喾N光反應性的物質(zhì)；例如，已知的是從用肉桂酸或胸腺嘧啶衍生 化的HA獲得的水凝膠（EP0554898 ;US6602859)和海綿類（EP1666503)。在這些情況中，將 透明質(zhì)酸鍵合于肉桂酸或胸腺嘧啶殘基，然后進行輻照以獲得水凝膠；對于海綿，將水凝膠 冷凍干燥或冷凍，然后進行第二次輻照周期。可以使用的另外的光反應性的物質(zhì)是苯基乙 基酮；經(jīng)由酯鍵與苯基乙基酮鍵合、然后進行輻照而從透明質(zhì)酸或其衍生物獲得的凝膠是 已知的（EP1519962)?，F(xiàn)有領域中已知的其它光反應性物質(zhì)是蒽、核黃素、香豆素和尿嘧啶， 對其進行適當衍生化和取代以促進與多糖的鍵合，所述是多糖通常是酯或酰胺類型的，且 因此包括多糖中常出現(xiàn)的-OH、-C00H和-NH 2基團。多糖經(jīng)常在反應前被衍生化，例如以保 護一些官能團或以促進所需鍵的形成。水凝膠的特性、諸如緊密度、水合能力、機械強度等， 可以通過調(diào)節(jié)各種參數(shù)來改變（多糖類型、光反應性、兩個整體之間的鍵、與多糖相比光反 應性物質(zhì)的百分比、輻照的強度和持續(xù)時間）。
[0007] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，申請人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)經(jīng)由特定的間隔基與特定的光反應性 物質(zhì)鍵合的透明質(zhì)酸在適合的UV輻照之后生成具有卓越的緊密度的水凝膠，其是生物可 降解的、生物相容的、無毒的，且具有形狀記憶特性；換言之所述水凝膠保持它們在其中被 制備的容器的形狀，且可以在切割的同時保持它們的結構，或者非常容易操作。本文所要求 的海綿也具有這些相同的特性，具有創(chuàng)新性的是其不是如迄今為止的現(xiàn)有技術所述那樣從 水凝膠獲得，而是從與間隔基和光反應性物質(zhì)鍵合的透明質(zhì)酸的溶液開始、隨后經(jīng)冷凍干 燥、最后進行UV輻照來獲得；不同于已知的海綿，由此僅需要單一輻照步驟，這代表了相當 巨大的工業(yè)優(yōu)勢。海綿還具有形狀記憶特性，且因此可以被重復浸濕和擠壓，而仍然保持相 同的形狀和結構特性以及需要單一 UV輻照。本申請人已經(jīng)證實該套特性與特定間隔基的 使用相關，其使得與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明具有新穎性和創(chuàng)造性。
[0008] 具體而言，實施例8和圖8闡述了根據(jù)所述現(xiàn)有專利EP1519962(其為本申請人所 擁有）的實施例2制備的水凝膠和根據(jù)本申請的實施例15制備的水凝膠的膨脹度的比較 數(shù)據(jù)。由于后一類水凝膠吸收的水更少，它們是更加緊密的，因而交聯(lián)是更加有效的。
[0009] 發(fā)明詳沐
[0010] 本發(fā)明公開和要求了透明質(zhì)酸（HA)的光交聯(lián)的衍生物、它們的基于適當制備的 可光交聯(lián)的中間體的UV輻照的通過交聯(lián)的制備方法、以及所述光交聯(lián)的衍生物在醫(yī)藥領 域的應用。本文所述的光交聯(lián)的衍生物采用不同緊密程度的水凝膠形式或者采用海綿形 式，即具有相互連接的孔的三維結構。它們是生物相容的、生物可降解的、無毒的，且尤其是 可以調(diào)節(jié)它們的緊密程度或孔隙率。這些發(fā)明的另外的特性為形狀記憶，即保持它們形狀 的能力、甚至在制備它們的容器之外以及對海綿而言在重復浸濕和擠壓之后保持它們形狀 的能力。本發(fā)明的產(chǎn)品可以應用于眾多醫(yī)學和生物醫(yī)學領域。水凝膠例如可以用于：
[0011] ?包囊于它們中的或化學鍵合于它們的活性成分的釋放；各種活性成分包括藥理 學和/或生物學活性物質(zhì)、諸如營養(yǎng)因子、抗生素、留體和非留體抗炎藥、蛋白質(zhì)、肽、激素 和血小板提取物；
[0012] ?用于醫(yī)藥應用的對象的包衣；
[0013] ?將固體材料、諸如骨粉、珊瑚顆粒、生物陶瓷和羥基磷灰石包囊，使用其可以將用 于整形外科、口腔醫(yī)學等領域的糊劑進行模型塑造；
[0014] ?填充在軟組織、諸如皺紋、凹陷瘢痕中的各種尺寸的缺損和源自外科手術的洞；
[0015] ?用作細胞生長和組織、諸如骨、脂肪組織、皮膚、軟骨、腱、韌帶、肌肉、神經(jīng)組織、 內(nèi)皮組織、結締組織等再生的支架?？梢栽谥踩肭皩⒓毎o論分化的或未分化的）插入 支架中，并適當?shù)嘏囵B(yǎng)；或者，可以將支架插入待治療的損害（lesion)處，并放置以使其被 損害位置生理性存在的細胞建群。對于該類型應用，其尤其可以用于將透明質(zhì)酸在輻照前 與膠原蛋白混合，所述膠原蛋白保持被物理捕獲在形成的水凝膠網(wǎng)中，所述膠原蛋白賦予 所述水凝膠更大的彈性，并改善其結構能力（structural capacity)和對其將被放置的位 置的適應；
[0016] ?用作手術后防止粘連的機械屏障和保護組織免受炎性損害；
[0017] ?通過關節(jié)內(nèi)注射治療骨關節(jié)炎和/或軟骨損傷。再次，如上文所述，水凝膠可以 包含分化的或未分化的細胞和/或藥理學或生物學活性物質(zhì)。
[0018] 由于海綿在它們的孔中收藏細胞的能力，其尤其可用于組織工程學領域（例如用 于皮膚、骨、軟骨、脂肪組織、腱、韌帶、肌肉、神經(jīng)、內(nèi)皮和結締組織）；如在水凝膠類的情況 中，可以在植入前將細胞（分化的或未分化的）插入支架中，并適當?shù)嘏囵B(yǎng)；或者，可以將支 架插入待治療的損害處，并放置以使其被損害位置生理性存在的細胞建群。由于它們的結 構，海綿特別適用于在形成腔洞的和深的損害（諸如大切除手術（乳腺、黑素瘤或深痣的全 部和部分切除）后形成的那些）中的組織重建。
[0019] 海綿也可以用作（如同水凝膠）骨或牙科損害的填充材料（任選地與藥理學和/ 或生物學活性物質(zhì)組合），以及最后用于骨關節(jié)炎和軟骨損傷的關節(jié)內(nèi)治療。在冷凍干燥 (其在輻照之前）前將膠原蛋白加入海綿，這又賦予它們更好的穩(wěn)定性和彈性的結構特性， 且使得它們特別適用于其將被使用的位置的形狀和尺寸。
[0020] 本發(fā)明涉及的衍生物由以下構成：
[0021] ?透明質(zhì)酸；
[0022] ?特定的雙功能PEG間隔基；
[0023] ?光反應性物質(zhì)，其選自苯基乙基酮和香豆素衍生物
[0024] 其（如下文所述那樣鍵合）形成可光交聯(lián)中間體，后者從而在UV輻照后，生成本 文描述和要求的水凝膠和海綿形式的光交聯(lián)的衍生物。如所述，所述衍生物可以任選地包 含膠原蛋白，用于以上述及的目的。
[0025] 更具體地，本發(fā)明的第一個目的是透明質(zhì)酸（HA)的光交聯(lián)的衍生物，其由HA、作 為三甘醇的雙功能聚乙二醇（PEG)間隔基和選自香豆素衍生物和苯基乙基酮的光反應性 的化合物構成。
[0026] 如所述，使用的多糖為透明質(zhì)酸，已經(jīng)描述了其主要特性。具體而言，本文使 用的HA可以源自任何來源、諸如來自公雞雞冠提?。‥P 138572)，發(fā)酵（從馬鏈球菌 (Streptococcus equi)或獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus))或生物合成（來 自Bacillus)，且具有10kDa至1000kDa的范圍的平均分子量、優(yōu)選40k Da至700kDa、且 甚至更優(yōu)選160kDa至220kDa的范圍的平均分子量；最后這個部分在下文被簡稱"具有 200kDa平均MW的HA"。需要強調(diào)的是在本說明書中，"平均分子量"意指通過"特性粘度 (intrinsic viscosity) "方法計算得到的重量平均分子量（Terbojevich等人，Carbohydr Res, 1986, 363-377)。
[0027] 對于間隔基，聚乙二醇（PEG)適用于本發(fā)明的目的。PEG通過環(huán)氧乙烷的聚合獲 得；其由直鏈構成，且由于多能性其廣泛用于化學和制藥工業(yè)，尤其是其沒有毒性。其還是 雙功能間隔基，可以在其鏈的兩個末端鍵合于不同的分子。取決于聚合程度，其可以具有極 其不同的M