本發(fā)明涉及藥物的技術(shù)領(lǐng)域,具體說(shuō)是一種抑肽酶的用途及寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法。
背景技術(shù):
寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)屬黃病毒科(Fla.viviridae),黃病毒屬(Flavivirus),呈球形,直徑約為40—70 nm,有包膜。黃熱病病毒屬于黃熱病科黃熱病毒屬的病毒,為RNA病毒,具有嗜內(nèi)臟性及嗜神經(jīng)性,在室溫下容易死基因組為單股正鏈RNA,長(zhǎng)度約為10.8Kb?;蚪M包含一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼一個(gè)多聚蛋白。
寨卡病毒最早于1947年從烏干達(dá)森林中的獼猴身上分離出來(lái)。1952年首次從人體分離出來(lái)。截至上世紀(jì)末,寨卡病毒感染被認(rèn)為僅在赤周圍的非洲、美洲、亞洲和太平洋地區(qū)散發(fā),被證實(shí)的人類感染病例僅14例。該病毒自2007年開(kāi)始出現(xiàn)暴發(fā)流行。2015年底至2016年初,美洲出現(xiàn)寨卡疫情,并通過(guò)旅游者輸入到其他國(guó)家。截至2016年2月,美洲、非洲、亞洲等地已有超過(guò)30個(gè)國(guó)家出現(xiàn)寨卡病毒傳播。雖然寨卡病毒感染者大部分癥狀較輕微,通常在發(fā)病3—7天后可自行痊愈,但醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為這種快速傳播的病毒可能與異常增多的新生兒小頭畸形有關(guān)聯(lián)。2016年2月1日,世界衛(wèi)生組織召開(kāi)緊急會(huì)議,宣布寨卡病毒的暴發(fā)和傳播已經(jīng)構(gòu)成全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件。之后越來(lái)越多的證據(jù)顯示寨卡病毒感染和胎兒畸形以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間存在因果關(guān)系。。寨卡病毒表達(dá)的蛋白酶是抗寨卡感染的理想靶標(biāo)。
因此測(cè)出寨卡病毒表達(dá)的蛋白酶的活性并篩選出好的活性抑制劑對(duì)殺死這種病毒的傳播起著至關(guān)重要的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抑肽酶的用途及寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法。
本發(fā)明為解決公知技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題所采取的技術(shù)方案是:
本發(fā)明的抑肽酶用于寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性抑制劑的用途。
本發(fā)明還可以采用以下技術(shù)措施:
抑肽酶即為Aprotinin,針對(duì)寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶為NS2B-NS3。
本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法,包括以下步驟:
A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素;
B、從平板上挑取多個(gè)單克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體,并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收,之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比5:1至10:1的比率混合在16℃下連接10到18h;
C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒,用于鑒定和測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示可用;
D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,并用LB平板篩選陽(yáng)性克?。?/p>
E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆,培養(yǎng)過(guò)夜,然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素,當(dāng)OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí),加入IPTG并于16℃培養(yǎng)16-18個(gè)小時(shí);
F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞,然后高壓破菌5-6次;破菌液12000rpm離心30min后收集上清液;
G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中,該懸菌溶液為20mM Tris,PH 8.5, 300mM Nacl,20mM咪唑,掛柱1個(gè)小時(shí);
H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白,該破菌緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,20mM咪唑,然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái),至G250檢測(cè)不變藍(lán),洗脫緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,500mM咪唑;
I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化,得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分;
J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物;熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm;蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度,分別進(jìn)行測(cè)定;蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油,PH=9.0,1 mM CHAPS;
K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax;
L、選取最優(yōu)熒光底物濃度,選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定;
M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC50的擬合,根據(jù)Ki=IC50/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。
步驟J中熒光底物的濃度分別選擇150μM 、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM。
步驟L中,熒光底物的最優(yōu)濃度為100μM,抑制劑濃度梯度為25μM、20μM、15μM 、10μM、5μM 、2.5μM 、1.25μM 、0.625μM 、0.3125μM。
利用底物AC-LKRR-AMC測(cè)得的蛋白酶活性的Km=85.32±2.11μM ,Kcat=1149.19±69.0710-3 s-1, Kcat/Km=13469M-1S-1;利用Aprotinin測(cè)得動(dòng)力學(xué)抑制常數(shù)Ki=0.361±0.019 μM。
采用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù);不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)數(shù)據(jù)使用 “nonlinear fit”-“straight line”來(lái)確定其擬合度,據(jù)此選擇前300s的反應(yīng)數(shù)據(jù)計(jì)算其初始線性反應(yīng)速率;不同底物濃度下的初始線性反應(yīng)速率中使用“nonlinear fit”“Michaelis–Menten”計(jì)算Km 與Vmax;將各底物濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)使用程序中“nonlinear fit”-“l(fā)og(inhibitor) vs.response-Variable slope”來(lái)進(jìn)行IC50的擬合。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
本發(fā)明的抑肽酶能夠寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性抑制劑,通過(guò)使用Aprotinin作為抑制劑的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法,通過(guò)優(yōu)選抑制劑的濃度,能夠?yàn)榭拐ú《镜母腥菊覝?zhǔn)方向,進(jìn)而推動(dòng)寨卡病毒的針對(duì)性藥物研發(fā)進(jìn)程。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性抑制劑的測(cè)定方法過(guò)程中的Km熒光圖;
圖2是本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性抑制劑的測(cè)定方法中的Aprotinin的IC50示意圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的抑肽酶用于寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性抑制劑的用途。
抑肽酶即為Aprotinin,針對(duì)寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶為NS2B-NS3。
A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素;
B、從平板上挑取多個(gè)單克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體,并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收,之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比5:1至10:1的比率混合在16℃下連接10到18h;
C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒,用于鑒定和測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示可用;
D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,并用LB平板篩選陽(yáng)性克?。?/p>
E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆,培養(yǎng)過(guò)夜,然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素,當(dāng)OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí),加入IPTG并于16℃培養(yǎng)16-18個(gè)小時(shí);
F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞,然后高壓破菌5-6次;破菌液12000rpm離心30min后收集上清液;
G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中,該懸菌溶液為20mM Tris,PH 8.5, 300mM Nacl,20mM咪唑,掛柱1個(gè)小時(shí);
H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白,該破菌緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,20mM咪唑,然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái),至G250檢測(cè)不變藍(lán),洗脫緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,500mM咪唑;
I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化,得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分;
J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物;熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm;蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度,分別進(jìn)行測(cè)定;蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油,PH=9.0,1 mM CHAPS;
K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax;
L、選取最優(yōu)熒光底物濃度,選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定;
M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC50的擬合,根據(jù)Ki=IC50/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。
實(shí)施例一:
本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法,包括以下步驟:
A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素;
B、從平板上挑取多個(gè)單克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體,并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收,之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比5:1的比率混合在16℃下連接10;
C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒,用于鑒定和測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示可用;
D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,并用LB平板篩選陽(yáng)性克??;
E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆,培養(yǎng)過(guò)夜,然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素,當(dāng)OD600達(dá)到0.6時(shí),加入IPTG并于16℃培養(yǎng)16個(gè)小時(shí);
F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞,然后高壓破菌5次;破菌液12000rpm離心30min后收集上清液;
G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中,該懸菌溶液為20mM Tris,PH 8.5, 300mM Nacl,20mM咪唑,掛柱1個(gè)小時(shí);
H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白,該破菌緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,20mM咪唑,然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái),至G250檢測(cè)不變藍(lán),洗脫緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,500mM咪唑;
I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化,得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分;
J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物;熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm;蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度,分別進(jìn)行測(cè)定;蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油,PH=9.0,1 mM CHAPS;
K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax;
L、選取最優(yōu)熒光底物濃度,選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定;
M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC50的擬合,根據(jù)Ki=IC50/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。
實(shí)施例二:
本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法,包括以下步驟:
A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素;
B、從平板上挑取多個(gè)單克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體,并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收,之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比10:1的比率混合在16℃下連接18h;
C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒,用于鑒定和測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示可用;
D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,并用LB平板篩選陽(yáng)性克??;
E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆,培養(yǎng)過(guò)夜,然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素,當(dāng)OD600達(dá)到0.8時(shí),加入IPTG并于16℃培養(yǎng)18個(gè)小時(shí);
F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞,然后高壓破菌6次;破菌液12000rpm離心30min后收集上清液;
G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中,該懸菌溶液為20mM Tris,PH 8.5, 300mM Nacl,20mM咪唑,掛柱1個(gè)小時(shí);
H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白,該破菌緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,20mM咪唑,然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái),至G250檢測(cè)不變藍(lán),洗脫緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,500mM咪唑;
I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化,得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分;
J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物;熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm;蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度,分別進(jìn)行測(cè)定;蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油,PH=9.0,1 mM CHAPS;
K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax;
L、選取最優(yōu)熒光底物濃度,選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定;
M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC50的擬合,根據(jù)Ki=IC50/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。
實(shí)施例三:
本發(fā)明的寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白酶活性的測(cè)定方法,包括以下步驟:
A、將含有全基因合成的寨卡病毒蛋白酶基因的載體pMV轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素;
B、從平板上挑取多個(gè)單克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取含有寨卡病毒蛋白酶基因片段的pMV載體,并將含有目的基因的pMV載體和目標(biāo)載體pET-duet-1雙酶切用瓊脂糖凝膠回收,之后將酶切回收的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比8:1的比率混合在16℃下連接15h;
C、將構(gòu)建好的片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂在LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,將篩選得到的陽(yáng)性克隆,分別接種于裝有5mL的LB培養(yǎng)基的試管培養(yǎng)過(guò)夜,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素,然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取構(gòu)建好的質(zhì)粒,用于鑒定和測(cè)序,測(cè)序結(jié)果顯示可用;
D、將得到的含有編碼寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶基因的pET-duet-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,并用LB平板篩選陽(yáng)性克??;
E、將D中所述的LB平板上挑取陽(yáng)性克隆,培養(yǎng)過(guò)夜,然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基中含100mg/L氨芐青霉素和氯霉素,當(dāng)OD600達(dá)到0.7時(shí),加入IPTG并于16℃培養(yǎng)17個(gè)小時(shí);
F、以5000 rpm離心15 min收集細(xì)胞,然后高壓破菌6次;破菌液12000rpm離心30min后收集上清液;
G、將上清液加入懸菌溶液預(yù)平衡的鎳柱中,該懸菌溶液為20mM Tris,PH 8.5, 300mM Nacl,20mM咪唑,掛柱1個(gè)小時(shí);
H、用破菌緩沖液清洗雜蛋白,該破菌緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,20mM咪唑,然后用洗脫緩沖液將目的蛋白洗下來(lái),至G250檢測(cè)不變藍(lán),洗脫緩沖液為20mM Tris,PH8.5,300mM Nacl,500mM咪唑;
I、將步驟H得到的寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶再用HiTrap Q 陰離子交換層析和superdex75 10/300 凝膠過(guò)濾層析進(jìn)行純化,得到寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶部分;
J、寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶的活性測(cè)定采用純度大于95%的熒光底物AC-LKRR-AMC作為底物;熒光強(qiáng)度測(cè)定的儀器為Fluoraskan Ascent酶標(biāo)儀,激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)分別為355nm和460nm;蛋白濃度為100nM,熒光底物選用多個(gè)濃度,分別進(jìn)行測(cè)定;蛋白緩沖液組分為10 mM Tris,20%體積百分?jǐn)?shù)的甘油,PH=9.0,1 mM CHAPS;
K、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,得到非結(jié)構(gòu)蛋白酶在達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度Km和酶的最大反應(yīng)速度Vmax;
L、選取最優(yōu)熒光底物濃度,選擇不同濃度的抑肽酶Aprotinin分別進(jìn)行測(cè)定;
M、分別獨(dú)立進(jìn)行多組測(cè)定,將不同濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行IC50的擬合,根據(jù)Ki=IC50/(1+[S]/Km)計(jì)算出Ki。
上述各實(shí)施例中的步驟J中熒光底物的濃度分別選擇150μM 、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM。
步驟L中,熒光底物的最優(yōu)濃度為100μM,抑制劑濃度梯度為25μM、20μM、15μM 、10μM、5μM 、2.5μM 、1.25μM 、0.625μM 、0.3125μM。
利用底物AC-LKRR-AMC測(cè)得的蛋白酶活性的Km=85.32±2.11μM ,Kcat=1149.19±69.0710-3 s-1, Kcat/Km=13469M-1S-1;利用Aprotinin測(cè)得動(dòng)力學(xué)抑制常數(shù)Ki=0.361±0.019 μM。[1]
采用GraphPad Prism軟件處理數(shù)據(jù);不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)數(shù)據(jù)使用 “nonlinear fit”-“straight line”來(lái)確定其擬合度,據(jù)此選擇前300s的反應(yīng)數(shù)據(jù)計(jì)算其初始線性反應(yīng)速率;不同底物濃度下的初始線性反應(yīng)速率中使用“nonlinear fit”“Michaelis–Menten”計(jì)算Km 與Vmax,結(jié)果如圖1所示;將各底物濃度下的反應(yīng)數(shù)據(jù)使用程序中“nonlinear fit”-“l(fā)og(inhibitor) vs.response-Variable slope”來(lái)進(jìn)行IC50的擬合,結(jié)果如圖2所示,可以得出抑肽酶Aprotinin對(duì)寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白酶中的NS2B-NS3具有明顯的抑制作用。
熒光底物AC-LKRR-AMC為上海吉爾生化有限公司的產(chǎn)品。
Fluoraskan Ascent熒光儀為美國(guó)Thermo Scientific的產(chǎn)品。
抑肽酶Aprotinin為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。
目標(biāo)載體pET-duet-1為Novagene公司產(chǎn)品。
應(yīng)當(dāng)注意,本發(fā)明中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)操作,均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù),如果在文中沒(méi)有特別說(shuō)明,則本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以參照本發(fā)明申請(qǐng)日之前的各種常用工具書(shū)、科技文獻(xiàn)或相關(guān)的說(shuō)明書(shū)、手冊(cè)等加以實(shí)施。
本文中所涉及的各種實(shí)驗(yàn)用品(包括但不限于:化學(xué)試劑、生物制品、細(xì)胞、生物體、儀器等)之中,對(duì)于那些特殊的或者不宜獲得的,文中均已注明了制造商、參考文獻(xiàn)或詳細(xì)的制備方法;未經(jīng)特別說(shuō)明的,均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)用品,在本發(fā)明申請(qǐng)日之前,可以通過(guò)各種方式(例如購(gòu)買、自行制備等)很方便地獲得。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以在形式和細(xì)節(jié)上對(duì)其做出各種改變和改進(jìn),而這些均被認(rèn)為落入了本發(fā)明的保護(hù)范圍。