本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及檢測(cè)與先天性角化不良癥有關(guān)的基因突變的引物和方法。
背景技術(shù):
先天性角化不良癥(dskeratosiseongenita,DC)是一種具有遺傳異質(zhì)性的骨髓衰竭綜合征,發(fā)病率約為1/100萬。典型的DC患者約80%~90%具有皮膚黏膜異常三聯(lián)征,表現(xiàn)為皮膚網(wǎng)狀色素沉著、指(趾)甲萎縮、口腔黏膜白斑。目前文獻(xiàn)報(bào)道可引起DC的突變基因主要有CTC1,DKC1,TERC,TERT,TINF2,NHP2,NOP10及WRAP53。文獻(xiàn)報(bào)道,這些基因有3種遺傳方式,分別為X-連鎖隱性遺傳、常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳。但目前仍約50%患者遺傳特征不明確。X-連鎖隱性遺傳包括DKC1,常染色體顯性遺傳包括TERC及TINF2,常染色體隱性遺傳包括CTC1,WRAP53,NHP2,NOP10,既可以作為常染色體顯性遺傳又可以作為隱性遺傳的有TERT。
端粒酶卡扎爾體蛋白1(telomerase cajal body protein 1,TCAB1又名WRAP53、WDR79)是2009年新發(fā)現(xiàn)的端粒酶關(guān)鍵核心蛋白組分,其主要存在于卡扎爾體蛋白中。WRAP53基因定位于染色體17p13上,共有10個(gè)外顯子,與P53基因重疊,是P53的反義轉(zhuǎn)錄基因,它不僅能調(diào)節(jié)p53基因的表達(dá)還能調(diào)節(jié)端粒的合成。WRAP53表達(dá)的缺失不會(huì)影響端粒酶活性及TERC水平,但可在細(xì)胞的S期阻止端粒酶與端粒結(jié)合,最終導(dǎo)致端粒變短。Zhong等發(fā)現(xiàn)WRAP53的突變阻止了端粒酶定位于卡扎爾體蛋白,導(dǎo)致了先天性角化不良癥的發(fā)生。近年來,通過全基因組測(cè)序,發(fā)現(xiàn)WRAP53基因突變?cè)谙忍煨越腔涣及Y患者中非常常見。目前文獻(xiàn)報(bào)道在兩個(gè)先天性角化不良癥的家族中發(fā)現(xiàn)WRAP53基因存在4個(gè)突變點(diǎn),分別為F164L(第2外顯子)、H376Y(第7外顯子)、R398W(第8外顯子)、G435R(第9外顯子)。目前國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的DC病例絕大多數(shù)為30歲左右皮膚受累的臨床病例,病例數(shù)較少,且較少進(jìn)行基因檢測(cè)。因此有必要進(jìn)行相關(guān)基因的突變檢測(cè),有必要先對(duì)患者進(jìn)行WRAP53基因進(jìn)行全外顯子突變篩選,有助于對(duì)先天性角化不良癥的早期診斷,減少誤診、漏診,并進(jìn)行治療。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)遺傳性WRAP53基因多態(tài)突變熱點(diǎn)的引物,采用PCR技術(shù),可用于快速檢測(cè)先天性角化不良癥患者體內(nèi)WRAP53基因多態(tài)位點(diǎn)的突變情況。所述檢測(cè)WRAP53基因多態(tài)熱點(diǎn)突變情況的引物,包括:
擴(kuò)增WRAP53基因的引物,其堿基序列為:
WRAP53-Exon1A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R:AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R:AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R:AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R:AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R:AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R:AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F:TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R:AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R:AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R:AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R:AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R:AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R:AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R:AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
進(jìn)一步地,還包括測(cè)序引物,其堿基序列為:
檢測(cè)WRAP53基因的測(cè)序引物堿基序列為:
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R:AACAGCTATGACCATG
進(jìn)一步地,引物序列WRAP53-Exon1A-F、WRAP53-Exon1A-R、WRAP53-Exon1B-F、WRAP53-Exon1B-R、WRAP53-Exon1C-R以及WRAP53-Exon1C-F是擴(kuò)增WRAP53基因第1外顯子序列的引物,引物序列WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R是擴(kuò)增WRAP53基因第2外顯子序列的引物,以此類推,引物序列WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R是擴(kuò)增WRAP53基因第10外顯子序列的引物。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)WRAP53基因全外顯子突變情況的方法,包括以下步驟:
1.抽提外周血中的基因組DNA;
2.用PCR擴(kuò)增步驟1中提取的DNA;
3.對(duì)步驟2中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序;
4.對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行判斷,確定WRAP53基因是否發(fā)生突變;
其中PCR擴(kuò)增引物為:
擴(kuò)增WRAP53基因的引物,其堿基序列為:
WRAP53-Exon1A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R:AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R:AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R:AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R:AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R:AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R:AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F:TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R:AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R:AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R:AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R:AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R:AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R:AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R:AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
進(jìn)一步地,還包括測(cè)序引物,其堿基序列為:
檢測(cè)WRAP53基因的測(cè)序引物堿基序列為:
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R:AACAGCTATGACCATG
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)WRAP53基因多態(tài)突變位點(diǎn)的試劑盒,包括:
(i)全血基因組DNA抽提試劑;
(ii)檢測(cè)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)液;
(iii)測(cè)序體系試劑;
其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)液引物為:
擴(kuò)增WRAP53基因的引物,其堿基序列為:
WRAP53-Exon1A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R:AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R:AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R:AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R:AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R:AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R:AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F:TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R:AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R:AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R:AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R:AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R:AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R:AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R:AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
進(jìn)一步地,測(cè)序引物堿基序列為:
M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R:AACAGCTATGACCATG
有益效果:本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增WRAP5310個(gè)外顯子序列的引物。通過加接頭,使所有13對(duì)引物的PCR產(chǎn)物均可以用一種測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。采用PCR技術(shù),構(gòu)建了穩(wěn)定的擴(kuò)增體系。通過調(diào)整引物濃度、退火溫度等反應(yīng)條件,可使擴(kuò)增效率達(dá)到最佳。WRAP53基因的突變類型種類多且遍布整個(gè)基因,因此本發(fā)明所述引物既能將所述WRAP53全部外顯子序列都擴(kuò)增出來,也保證無論這些外顯子的何處位置發(fā)生突變,都不會(huì)出現(xiàn)漏檢的情況。相比較熒光定量PCR法降低了檢測(cè)的成本和難度。熒光定量PCR法要針對(duì)不同的突變類型設(shè)計(jì)多個(gè)探針,成本高,檢測(cè)難度大。本發(fā)明的13對(duì)引物涵蓋了WRAP53基因全部外顯子區(qū)域,使得后續(xù)測(cè)序時(shí)的上下游引物均能測(cè)出目的片段,一定程度上保證了測(cè)序的準(zhǔn)確性。
附圖說明
圖1為WRAP53基因在染色體上定位圖。
圖2和圖3為WRAP53基因經(jīng)13對(duì)引物擴(kuò)增后所得產(chǎn)物的電泳圖譜,每對(duì)引物的擴(kuò)增均設(shè)有一個(gè)重復(fù),M為Marker DL 2000,如圖2和圖3所示,引物擴(kuò)增有效,且條帶單一。
圖4為樣本4WRAP53基因第2號(hào)外顯子引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物正反向測(cè)序圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是,實(shí)施例中未說明的常規(guī)條件和方法,通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法:譬如,奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版,或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
實(shí)施例1
一種檢測(cè)WRAP53基因多態(tài)突變位點(diǎn)的引物,該引物的設(shè)計(jì)是針對(duì)WRAP53全外顯子設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物,包括:
擴(kuò)增WRAP53基因全外顯子序列的引物,其堿基序列為:
WRAP53-Exon1A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R:AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R:AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R:AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R:AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R:AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R:AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F:TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R:AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R:AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R:AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R:AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R:AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R:AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R:AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
一種檢測(cè)WRAP53基因多態(tài)突變位點(diǎn)的試劑盒,包括
(i)全血基因組DNA抽提試劑;
(ii)檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液;
(iii)測(cè)序體系試劑;
其中,外周血基因組DNA提取所用試劑盒由天根生物科技有限公司提供。
檢測(cè)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括:
測(cè)序體系試劑包括:
實(shí)施例2
血液/細(xì)胞/組織基因組DNA抽提試劑盒(天根生物)的操作流程:
(1)全血基因組DNA提取
1)于1.5ml離心管底部加入20μl QIAGEN Protease(或proteinase K)。.
2)離心管中加入200μl血漿。
3)加入200μl Buffer AL,振蕩15s。(注意:不可將QIAGEN Protease或proteinase K直接加入到Buffer AL中。若樣本量較大,則QIAGEN Protease和Buffer AL按比例增加。)
4)56℃水浴10min,之后短暫離心,以除去離心管蓋內(nèi)沿的液體。
5)加入200μl乙醇(96%-100%),振蕩15s,短暫離心,以去除離心管蓋內(nèi)沿液體。
6)小心將以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp微型離心柱中(不要潤(rùn)濕離心柱邊緣)將離心柱放入2ml收集管中,蓋緊離心管蓋,以6000×g(8000rpm)離心1min。將離心柱取出,放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)。丟棄收集管及其中液體。
7)小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp微型離心柱中(不要潤(rùn)濕離心柱邊緣)。蓋緊離心管蓋,以6000×g(8000rpm)離心1min。將離心柱取出,放入一支潔凈的2ml收集管中(試劑盒提供)。丟棄收集管及其中液體。
8)小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp微型離心柱中(不要潤(rùn)濕離心柱邊緣)。蓋緊離心管蓋,以20000×g(14000rpm)離心3min。
9)將QIAamp微型離心柱置入一支新的2ml收集管中(自備),丟棄收集管及其中液體。全速離心1min。
10)將QIAamp微型離心柱置入一支潔凈1.5ml收集管中(自備),丟棄收集管及其中液體。小心在QIAamp微型離心柱中加入100μl Buffer AE或蒸餾水。室溫下(15-25℃)靜置1min,6000×g(8000rpm)離心1min。將收集管蓋好,保存于-20℃。
(2)試劑配置:按檢測(cè)人份數(shù)配置檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液各Xμl,每人份19μl分裝:
X=19μl反應(yīng)液×(n份標(biāo)本+1份空白對(duì)照)
n為檢測(cè)標(biāo)本數(shù)。
(3)加樣:在分裝好的PCR反應(yīng)管中加入DNA,空白對(duì)照加等量生理鹽水或不加任何物質(zhì)。加樣要求如下:
(4)擴(kuò)增:檢測(cè)在常規(guī)PCR儀上進(jìn)行,可用儀器包括ABI veriti(美國(guó)Applied Biosystems公司)等。反應(yīng)條件如下:
PCR擴(kuò)增體系試劑配制方法如下:
其中,引物序列為:
WRAP53-Exon1A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R:AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R:AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R:AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R:AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R:AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R:AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F:TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R:AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R:AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R:AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R:AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R:AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F:TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R:AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F:TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R:AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
(5)電泳:1.5%瓊脂糖凝膠電泳,110V,25min,凝膠成像系統(tǒng)觀察。
如圖2和圖3所示,即為引物擴(kuò)增后所得產(chǎn)物的電泳圖譜。圖2中1-A為WRAP53-Exon1A-F和WRAP53-Exon1A-R引物擴(kuò)增后的片段Exon1A,1-B為WRAP53-Exon1B-F和WRAP53-Exon1B-R引物擴(kuò)增后的片段Exon1B,1-C為WRAP53-Exon1C-F和WRAP53-Exon1C-R引物擴(kuò)增后的片段Exon1C,2為WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R引物擴(kuò)增后的片段Exon2,以此類推,圖3中10為WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R引物擴(kuò)增后的片段Exon10。通過電泳圖的分析表明本發(fā)明所述擴(kuò)增有效,且條帶單一。
(6)Sanger測(cè)序:
取9μl PCR產(chǎn)物與2μl純化體系。按照以下程序進(jìn)行純化:
將1μl純化產(chǎn)物分別與上、下測(cè)序引物按照如下體系進(jìn)行混合:
測(cè)序反應(yīng)程序:
沉淀環(huán)節(jié):
向完成測(cè)序反應(yīng)的產(chǎn)物中加入2μl 125mmol的EDTA,靜置5min;加入15:l無水乙醇,漩渦混勻;3700rpm離心30min;倒置離心15sec,加入50μl l70%乙醇,漩渦混勻;3700rpm離心15min;倒置離心15sec,置于95℃金屬浴上;加入10μl Hi-Di后進(jìn)行變性試驗(yàn)。變性程序:
變性程序結(jié)束后,上測(cè)序儀(ABI3730)測(cè)序。
(7)結(jié)果判斷:分別將測(cè)序結(jié)果與WRAP53基因參考序列(Genbankaccn:AC_000184.1)進(jìn)行比對(duì),根據(jù)實(shí)際突變情況對(duì)結(jié)果進(jìn)行報(bào)告。
實(shí)施例3
為了驗(yàn)證引物和整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的可行性,取13例臨床樣本(每對(duì)引物設(shè)兩個(gè)重復(fù),每組按引物編號(hào)為1-13)按實(shí)施例1和2的試劑和方法提取基因組、配制試劑、擴(kuò)增和測(cè)序。取其中樣本4加入引物擴(kuò)增,電泳結(jié)果如圖2和圖3所示,表明本發(fā)明所述引物對(duì)血液樣本能有效擴(kuò)增,且條帶單一。測(cè)序結(jié)果如下表所示。
圖4顯示是樣本4的WRAP53第2號(hào)外顯子野生型正反測(cè)序截圖,說明測(cè)序結(jié)果峰值清晰無雜峰和重峰等影響結(jié)果的干擾。
從檢測(cè)結(jié)果可以看出,本發(fā)明所述引物已經(jīng)把外顯子序列包括在內(nèi)了,能夠擴(kuò)展出WRAP53基因全部外顯子,并且測(cè)序結(jié)果完全準(zhǔn)確。本發(fā)明所述引物可以準(zhǔn)確的擴(kuò)展出WRAP53基因全外顯子,通過結(jié)果表明本發(fā)明所述引物和方法及試劑盒能夠檢測(cè)出WRAP53基因所有外顯子。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
<120> 檢測(cè)先天性角化不良癥WRAP53基因的方法和引物
<130>
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtgg gaacgggaaa ccttctaa 38
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aacagctatg accatggaca gcagtccgga gctaac 36
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aacagctatg accatgtctt ctgcaggaag gcttgt 36
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tgtaaaacga cggccagtgg gacccagttt ctctctcc 38
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<400> 28
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