本發(fā)明涉及分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)：指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。snp與許多疾病相關(guān)，決定了人類疾病的易感性和藥物反應的差異性。

分子信標(molecularbeacon)：是一種在5’和3’末端自身形成一個5-8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針。兩端的核酸序列互補配對，標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。在這種結(jié)構(gòu)下，熒光基團被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，所以不會產(chǎn)生熒光；在高溫變性或之后的退火雜交過程中，這種結(jié)構(gòu)被破壞，導致熒光基團遠離淬滅基團，熒光便能被激發(fā)并被監(jiān)測儀器探測到。

近年來藥物代謝種族及個體差異與藥物代謝酶基因的遺傳多態(tài)性的關(guān)系越來越受到研究者們的重視。細胞色素p450超家族(cytochromep450proteins,cyp)是一類主要存在于肝臟、腸道中的單加氧酶，可催化多種內(nèi)、外源物質(zhì)(包括大多數(shù)臨床藥物)的代謝。cyp有多個亞家族，其中cyp2c(cytochromep4502c)是其中一個亞家族，cyp2c9是其中一員，占肝微粒體p450蛋白總量的20％。據(jù)統(tǒng)計，目前約有16％的的臨床藥物由cyp2c9負責代謝，主要包括苯妥因、華法林、醋酸香豆素、甲苯磺丁脲等。cyp2c9基因具有遺傳多態(tài)性，cyp2c9*3是外顯子7的第1061位核苷酸a突變?yōu)閏，導致多肽鏈第359位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?。具有功能意義的基因突變導致cyp2c9酶活性降低，可使cyp2c9酶底物藥物療效下降或產(chǎn)生更多不良反應，甚至會危及生命，因此對cyp2c9代謝酶的基因檢測就尤為重要。經(jīng)實驗證實，cyp2c9*3的雜合子可以降低對s-華法林的代謝。在英國人群中，cyp2c9的多態(tài)性等位基因在華法林低劑量需求人群中的發(fā)生率明顯增加；在意大利人群中，cyp2c9的多態(tài)性也與華法林劑量的降低有關(guān)；在中國人口中,除了野生型cyp2c9*1，已發(fā)現(xiàn)的最主要的基因型是cyp2c9*3，其基因頻率約為3.3％。

目前，用于臨床檢測cyp2c9*3基因型的試劑盒均需要進行抽血及提純dna的步驟，從抽血提取dna到得出檢測結(jié)果的整個過程至少需要8小時?，F(xiàn)有模式的有創(chuàng)檢測不僅會降低受檢者的檢測舒適度，而且難以滿足臨床疾病的快速診斷，增加了患者疾病治療的風險，且操作復雜，污染的幾率大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、避免污染且檢測快速的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測所涉及的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的試劑盒，包括pcr反應液；pcr反應液的原料及終濃度為：dna聚合酶0.05-0.12u/μl；dntps0.2mm；5x反應緩沖液1x；mgcl21.5-3.5mm；十二烷基硫酸鈉0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03％(w/v)；正向引物0.5-1μm；反向引物0.5-1μm；突變型探針0.5-1μm；野生型探針0.5-1μm；且其用于檢測細胞樣品。

采用本發(fā)明技術(shù)方案的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的試劑盒，以細胞為檢測樣本，以熒光探針法為基礎(chǔ)，結(jié)合細胞裂解液(由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成)對cyp2c9*3進行檢測分析。利用細胞裂解液在反應過程中直接裂解細胞并釋放出細胞核中dna。在現(xiàn)有的pcr反應中，以細胞直接作為模板的pcr反應，通常無法徹底裂解細胞，并且裂解后的細胞碎片及一些細胞內(nèi)容物(如蛋白酶)對pcr反應有抑制，最終導致分型結(jié)果不穩(wěn)定，甚至失敗。而本發(fā)明中使用的裂解液采用與基因相關(guān)的原料終濃度，在增強細胞裂解程度的同時還降低了這些潛在的抑制劑對pcr的抑制作用(通過溶解細胞質(zhì)和細胞膜，破壞分子間微弱的化學鍵，分解一些蛋白酶)。細胞裂解液的作用是溶解細胞質(zhì)和細胞膜，繼而破壞分子間許多微弱的化學鍵，分解蛋白酶，從而降低細胞裂解之后產(chǎn)生的雜質(zhì)對pcr反應的影響。細胞裂解液的原料由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成。聚乙二醇辛基苯基醚是一種非離子型表面活性劑，十二烷基硫酸鈉是一種能夠使蛋白質(zhì)變性的強陰離子去污劑。在細胞和分子生物學領(lǐng)域，十二烷基硫酸鈉，簡稱sds，被用于核酸抽提操作中破壞細胞壁及裂解核酸與蛋白復合物，在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與dna的結(jié)合，使dna釋放出來。聚乙二醇辛基苯基醚簡稱tritonx-100，被用于分解蛋白酶，聚乙二醇辛基苯基醚在基因工程中還用作限制性內(nèi)切酶的緩沖液的成分之一。

由實驗可知，pcr反應液的原料、特異性引物及分子信標的終濃度范圍為上述范圍時檢測結(jié)果均正確。其中，5x反應緩沖液1x的原料為5x反應緩沖液，指的是初始濃度為5倍的反應緩沖液，1x是指的應用的終濃度。

通過這一發(fā)明點不僅大大節(jié)省了檢測的時間，操作的時間可控制在1-1.5h，還避免了繁瑣操作可能帶來的dna污染。

進一步，所述的pcr反應液的原料終濃度為：dna聚合酶0.09u/μl；dntps0.2mm；5x反應緩沖液1x；mgcl22.5mm；十二烷基硫酸鈉0.005％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚0.01％(w/v)；正向引物0.7μm；反向引物0.7μm；突變型探針0.7μm；野生型探針0.6μm。

由實驗可知，pcr反應液的終濃度為上述范圍時檢測結(jié)果最準確，且準確率最高。

進一步，所述的細胞樣品為口腔黏膜脫落細胞。本發(fā)明以直接刮取的口腔黏膜脫落細胞為樣本，操作方便。

進一步，還包括有提純的人類dna基因序列。試劑盒中包括質(zhì)控品，為提純的人類dna基因序列，是在測定時為了做平行試驗，來測定試劑結(jié)果的有效性。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，本發(fā)明試劑盒中的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的引物，

正向引物5’-3’的基因序列為：ctgcatgcaagacagga；

反向引物5’-3’的基因序列為：aacttaccttgggaatgaga。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，試劑盒中引物檢測的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的分子信標，野生型探針的5’-3’的基因序列為：cgacgtgata+c+a+ttgaccttctcccacgtcg；

突變型探針的5’-3’的基因序列為：cgcacgcagagata+c+c+ttgaccttccgtgcg；

且野生型探針和突變型探針基因序列的5’端或3’端分別設有熒光基團和與熒光基團配合的熒光淬滅基團。

+為鎖核酸修飾的堿基。

本技術(shù)方案使用了分子信標探針，分子信標為一種在5’和3’末端可自身形成由5-8個堿基組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸探針。即為上述探針的基因序列和結(jié)構(gòu)。自由狀態(tài)時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個末端使熒光分子與淬滅分子靠近(約為7-10nm)。此時發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,使熒光分子發(fā)出的熒光被淬滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被淬滅。當分子信標與細胞的基因序列完全互補的靶標序列結(jié)合形成雙鏈雜交體時，莖結(jié)構(gòu)互補區(qū)的堿基對被分開，熒光分子和淬滅分子之間距離增大，這時分子信標的熒光幾乎100％恢復。這種設計能有效地增加探針的特異性，提高對cyp2c9*3檢測的正確性。

檢測的原理為：利用熒光探針法(分子信標技術(shù))對cyp2c9*3等位基因進行定性檢測。檢測時利用兩對特異性引物分別對兩條目的片段進行擴增。再通過兩對由不同熒光基團標記，且可與這些位點不同堿基互補的分子信標探針與擴增片段進行特異性雜交。雜交過程致使熒光基團遠離淬滅基團從而釋放熒光信號。隨著擴增片段數(shù)量的積累，熒光信號也得到相應的增加并被儀器采集。通過配套軟件對采集的熒光信號進行分析，即可獲得所檢測樣本的基因型。

進一步，所述的熒光基團為fam標記基團，所述的淬滅基團為bhq1標記基團；

或者熒光基團為alexafluor594標記基團，所述的淬滅基團為bhq2標記基團。以上為本發(fā)明中所使用的兩種熒光基團和淬滅基團，當然，也可用其他熒光基團和與其配合的淬滅基團代替，不影響檢測結(jié)果。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，利用上述的引物、分子信標及試劑盒進行的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測方法，操作方法為，

(1)取樣前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；

(2)取取樣裝置的取樣部近90°接觸口腔內(nèi)腮壁，均勻刮拭5次，上、下為1次；

(3)取樣后將取樣裝置的取樣部插入pcr反應液中，混勻；

(4)取1μl提純的人類基因組dna基因序列加入到另一支pcr反應液中，混勻；

(5)將完成加樣的pcr反應液放入定量pcr儀中，運行反應程序。

進一步，其定量pcr儀的反應程序為：

a、預變性：溫度95℃，5min，1個循環(huán)；

b、變性：95℃，8s；

c、退火及延伸：55℃，35s；

d、b、c程序操作50個循環(huán)。

進一步，所述的定量pcr儀為雙通道，激發(fā)波長分別為450-500nm和550-600nm。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例一的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖2是本發(fā)明實施例一的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖3是本發(fā)明實施例一的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖4是本發(fā)明實施例二的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖5是本發(fā)明實施例二的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖6是本發(fā)明實施例二的第三個樣品檢測擴增曲線圖；

圖7是本發(fā)明實施例三的第一個樣品檢測擴增曲線圖；

圖8是本發(fā)明實施例三的第二個樣品檢測擴增曲線圖；

圖9是本發(fā)明實施例三的第三個樣品檢測擴增曲線圖。

具體實施方式

以下是本發(fā)明cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測試劑盒中的各實施例的原料終濃度，如表1所示：

表1

以下為本發(fā)明cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的具體操作方式：

一、細胞裂解液的配制

不同總濃度的細胞裂解液均配制成為200×的儲存液，首先是因為每一支反應液所需原料少，加之聚乙二醇辛基苯基醚為粘稠液體，不易精準吸取。

所有試劑配制均在滅菌后的超凈工作臺進行。

(1)實施例一中200x細胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入10μlsds和1.88μltritonx-100，再加入988.12μl無核酸酶的水至總體積1000μl，使sds的終濃度達到0.1％，使tritonx-100的終濃度達到0.2％，即為200x的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

(2)實施例二中200x細胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入100μlsds和18.78μltritonx-100，再加入881.22μl無核酸酶的水至總體積1000μl，使sds的終濃度達到1％，使tritonx-100的終濃度達到2％，即為200x的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

(3)實施例三中200x細胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入300ulsds和56.34ultritonx-100，再加入643.66ul無核酸酶的水至總體積1000ul，使sds的終濃度達到3％，使tritonx-100的終濃度達到6％，即為200x的細胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

正向引物5’-3’的基因序列為：ctgcatgcaagacagga；

反向引物5’-3’的基因序列為：aacttaccttgggaatgaga。

野生型探針5’-3’的基因序列為：

(fam標記)-cgacgtgata+c+a+ttgaccttctcccacgtcg-(bhq1標記)；

突變型探針5’-3’的基因序列為：

(alexafluor594標記)-cgcacgcagagata+c+c+ttgaccttccgtgcg-(bhq2標記)；

+為鎖核酸修飾的堿基。

上述原料，除特異性引物、分子信標、細胞裂解液外，均購自上海普洛麥格生物制品有限公司。特異性引物由上海占標生物科技有限公司合成；分子信標由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

二.pcr反應液配制

各原料的加入量如表2所示。所有配制均在滅菌后的超凈工作臺進行。

表2

三、cyp2c9*3基因型檢測；

cyp2c9*3基因型快速檢測試劑盒由9支分裝好的試劑管組成，每個被測者檢測3次重復(一次一支反應液)，每測試9支試劑，同時測試一次質(zhì)控品，質(zhì)控品即為提純的人類基因組dna基因序列樣品，作為平行測試。

將配制好的pcr反應液分裝于試劑管中，實施例一、二、三每支分裝23.5μl，-20℃避光保存；

(1)取樣前用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，盡量避免口腔內(nèi)壁殘留唾液；

(2)取出一次性使用無菌拭子(專利授權(quán)公告號：cn205359515u)及反應液，拔掉反應液塞子及拭子端蓋；

(3)使拭子端部近90°接觸口腔內(nèi)腮壁，實施例一、二、三均勻刮拭5次(上下為1次)，力度以腮部微突為宜；

(4)取樣后立即將拭子插入反應液中，按壓頂部使其與試劑管密封，而后輕彈試劑管使樣本與反應液充分混勻；

(5)用移液器取1μl質(zhì)控品加入到另一支反應液中，輕彈試劑管并混勻；

(6)將完成加樣的反應液放入om-1000型熒光pcr儀器(專利授權(quán)公告號：cn103820306b)中，并運行表3中程序。

表3

(7)得到擴增曲線和熒光顏色，分析結(jié)果。

四、結(jié)果分析：

標記姓名、科室、針對藥物等，一個小時后觀察結(jié)果。結(jié)果有三種情況，分別是“aa”、“ac”或“cc”，其中陰性結(jié)果是“aa”，陽性結(jié)果是“ac”和“cc”。

實施例一的檢測結(jié)果為：

如圖1、圖2和圖3所示，圖中a線表示未檢測到cyp2c9*3，c線表示檢測到cyp2c9*3。

由圖1可知，只有a線有指數(shù)增長，而c線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生純合型aa，提示所檢測基因表達或活性可能正常，該基因型為正常代謝型；

由圖2可知，a線和c線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變雜合型ac，提示所檢測基因活性可能下降，該基因型屬于中等代謝型；

由圖3可知，只有c線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變純合型cc，提示所檢測基因活性明顯下降或可能喪失，其活性下降或喪失可能導致藥物活性成分血藥濃度降低；

由此，可從圖1、圖2和圖3中分析得出cyp2c9*3的基因型，從而可得出，患者對藥物的代謝類型。

實施例二的檢測結(jié)果為：

如圖4、圖5和圖6所示，圖中a線表示未檢測到cyp2c9*3，c線表示檢測到cyp2c9*3。

由圖4可知，只有a線有指數(shù)增長，而c線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生純合型aa；

由圖5可知，a線和c線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變雜合型ac；

由圖6可知，只有c線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變純合型cc；

由此，可從圖4、圖5和圖6中分析得出cyp2c9*3的基因型。

實施例三的檢測結(jié)果為：

如圖7、圖8和圖9所示：

由圖7可知，只有a線有指數(shù)增長，而c線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型aa；

由圖8可知，a線和c線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是雜合變異型ac；

由圖9可知，只有c線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合變異型cc；

由此，可從圖7、圖8和圖9中分析得出cyp2c9*3的基因型。

實施例一～實施例三的測試均能正確進行得出cyp2c9*3位點的基因型分型，從而可知被測試對象的藥物代謝類型。但實施例一中，引物的使用量較實施例二、三少，導致其分型曲線較后兩者進入平臺期的循環(huán)晚。雖實施例二、三差異不大，但從突變雜合型觀察到實施例三配方顯示兩曲線各循環(huán)間熒光強度波動較大，因此選擇實施例二中配方比例作為最優(yōu)配方。

本發(fā)明的核苷酸序列表如下：

<110>重慶京因生物科技有限責任公司

<120>cyp2c93基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法

<160>4

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

ctgcatgcaagacagga

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

aacttaccttgggaatgaga

<210>3

<211>34

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

cgacgtgata+c+a+ttgaccttctcccacgtcg

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

cgcacgcagagata+c+c+ttgaccttccgtgcg。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。

<110>重慶京因生物科技有限責任公司

<120>cyp2c93基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標、試劑盒及其檢測方法

<160>4

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

ctgcatgcaagacagga

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

aacttaccttgggaatgaga

<210>3

<211>34

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

cgacgtgata+c+a+ttgaccttctcccacgtcg

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

cgcacgcagagata+c+c+ttgaccttccgtgcg。