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多核苷酸合成的方法與流程

文檔序號(hào):39729715發(fā)布日期:2024-10-22 13:34閱讀:來源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種核酸合成的方法,所述方包括:

2.一種方法,所述方法包括:

3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法,其中所述核苷酸是經(jīng)修飾的核苷酸。

4.如權(quán)利要求1所述的方法,所述方法進(jìn)一步包括在添加所述綴合物之后裂解所述接頭以去除連接至所述多核苷酸的所述聚合酶。

5.如權(quán)利要求1所述的方法,所述方法進(jìn)一步包括將所述綴合物試劑與所述磷酸酶一起孵育,并且所述孵育水解至少一個(gè)未遮蔽的核苷酸的至少一個(gè)末端5'磷酸。

6.如權(quán)利要求5所述的方法,其中在使所述樣品與所述綴合物試劑接觸之前進(jìn)行所述綴合物試劑與所述磷酸酶的所述孵育。

7.如權(quán)利要求6所述的方法,其中在使所述樣品與所述綴合物試劑接觸之前從所述綴合物試劑中去除所述磷酸酶。

8.如權(quán)利要求5所述的方法,其中在使所述樣品與所述綴合物試劑接觸之后進(jìn)行所述綴合物試劑與所述磷酸酶的所述孵育。

9.如權(quán)利要求1或3-8中任一項(xiàng)所述的方法,所述方法進(jìn)一步包括重復(fù)如權(quán)利要求1或3-8中任一項(xiàng)中所述的每個(gè)步驟一次或多次以合成延長(zhǎng)的多核苷酸。

10.如權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述磷酸酶不會(huì)去除所述綴合物的遮蔽的核苷酸的末端5'磷酸。

11.如權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述未遮蔽的核苷酸不與聚合酶連接。

12.如權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述未遮蔽的核苷酸是綴合物的一部分:

13.如權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述磷酸酶是堿性磷酸酶或非堿性磷酸酶。

14.如權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述聚合酶包含模板非依賴性聚合酶。

15.如權(quán)利要求14所述的方法,其中所述模板非依賴性聚合酶是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)或其變體。

16.如權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述聚合酶包含模板依賴性聚合酶。

17.如權(quán)利要求16所述的方法,其中所述聚合酶包含dna聚合酶。

18.如權(quán)利要求16所述的方法,其中所述聚合酶包含rna聚合酶。

19.如權(quán)利要求9所述的方法,其中與使用未與磷酸酶一起孵育的在其它方面相同的綴合物試劑的相同合成相比,所述多核苷酸合成中的非終止率降低。

20.如權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述接頭是可裂解接頭。

21.如權(quán)利要求1或2所述的方法,其中所述磷酸酶去除所述未遮蔽的核苷酸的所述末端5'磷酸。

22.一種包含多個(gè)綴合物的組合物,其中每個(gè)綴合物包含連接至聚合酶的核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸,其中由所述組合物的連接的聚合酶遮蔽的核苷酸的純度相對(duì)于所述組合物中的核苷酸的總量大于約80%、約85%、約90%、約95%、約97%、約98%、約99%、約99.5%、或約99.9%、或約99.9%。

23.如權(quán)利要求22所述的組合物,其中所述多個(gè)綴合物包含小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%、小于約1%、小于約0.5%、小于約0.1%、小于約0.05%或小于約0.01%的未遮蔽的核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸。

24.如權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的組合物,所述組合物還包含磷酸酶。

25.如權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)所述的組合物,其中所述多個(gè)綴合物能夠?qū)⒑怂岱肿友由煲粋€(gè)核苷酸。

26.如權(quán)利要求22至24中任一項(xiàng)所述的組合物,其中所述多個(gè)綴合物能夠?qū)⒑怂岱肿友由觳怀^一個(gè)核苷酸。

27.如權(quán)利要求25或權(quán)利要求26所述的組合物,其中所述核酸分子是單鏈的。

28.如權(quán)利要求25或權(quán)利要求26所述的組合物,其中所述核酸是雙鏈的。

29.一種合成包含預(yù)定序列的多核苷酸的方法,所述方法包括使核酸分子與權(quán)利要求22至26中任一項(xiàng)所述的組合物接觸。

30.如權(quán)利要求29所述的方法,其中所述方法產(chǎn)生包含所述預(yù)定序列的多核苷酸產(chǎn)物。

31.如權(quán)利要求30所述的方法,其中與所述產(chǎn)物中的所有多核苷酸相比,所述多核苷酸產(chǎn)物具有小于約5%、小于約4%、小于約3%、小于約2%、小于約1%、小于約0.5%、小于約0.1%、小于約0.05%或小于約0.01%的包含不是所述預(yù)定序列的序列的多核苷酸。

32.如權(quán)利要求29所述的方法,其中所述核酸分子是單鏈的。

33.如權(quán)利要求29所述的方法,其中所述核酸分子是雙鏈的。

34.一種方法,所述方法包括:處理包含聚合酶-核苷酸綴合物的組合物,包括使所述組合物與磷酸酶接觸的步驟,其中所述磷酸酶能夠去除未遮蔽的核苷酸的末端5'磷酸。

35.一種減少核酸分子合成中的一個(gè)或多個(gè)非終止反應(yīng)的方法,其中所述合成在包含一個(gè)或多個(gè)未遮蔽的核苷酸的環(huán)境中進(jìn)行,并且其中所述減少包括:使包含聚合酶-核苷酸綴合物的綴合物試劑與磷酸酶接觸,其中所述聚合酶-核苷酸綴合物包含通過接頭栓系至所述聚合酶的核苷酸,并且其中所述磷酸酶能夠去除所述一個(gè)或多個(gè)未遮蔽的核苷酸的所述末端5'磷酸。

36.如權(quán)利要求36所述的方法,其中與在相同條件下但不存在磷酸酶的情況下進(jìn)行的合成相比,在磷酸酶存在下進(jìn)行的合成反應(yīng)中發(fā)生的非終止的數(shù)量減少。

37.如權(quán)利要求34-37中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述核苷酸是經(jīng)修飾的核苷酸。


技術(shù)總結(jié)
本文公開了用于核酸分子的從頭酶促合成的組合物和方法。特別地并且除其它事項(xiàng)外,本公開的組合物和方法提供了通過從頭酶促合成產(chǎn)生的核酸分子產(chǎn)物中的非終止的減少。本公開的組合物和方法還包括使用磷酸酶來促進(jìn)非終止的減少。

技術(shù)研發(fā)人員:E·埃斯特林,S·帕爾魯克,D·阿洛
受保護(hù)的技術(shù)使用者:安薩生物技術(shù)公司
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2024/10/21
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