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一種dna聚合酶錯配率的檢測方法

文檔序號:8917775閱讀:3395來源:國知局
一種dna聚合酶錯配率的檢測方法【
技術(shù)領(lǐng)域
】[0001]本發(fā)明涉及一種生物學檢測方法。更具體地,涉及一種酶學檢測方法?!?br>背景技術(shù)
】[0002]DNA聚合酶保真性檢測的經(jīng)典方法,是利用藍白斑顯色的方法,以藍白斑比例的形式反映DNA聚合酶擴增LacZα基因時的突變率,來衡量DNA聚合酶保真性。最傳統(tǒng)的方法是利用λ噬菌體攜帶擴增的LacZa基因,感染細胞后進行藍白斑顯色,例如KellyS.Lundberg等(High-fidelityamplificationusingathermostableDNApolymeraseisolatedfromPyrococcusfuriosus,1991,Gene)、JaniceCline等(PCRfidelityofPfuDNApolymeraseandotherthermostableDNApolymerases,1996,NucleicAcidsResearch)。該方法操作繁瑣,且有造成實驗室發(fā)生噬菌體污染的風險。也有學者開發(fā)出基于質(zhì)粒而非菌體的檢測方法,如StanislawK等(Plasmid-basedLacZaassayforDNApolymerasefidelity:applicationtoarchaealfamiIy-BDNApolymerase,2009,NucleicAcidsResearch)、BrianJ.Keith等(Aplasmid-basedIacZageneassayforDNApolymerasefidelitymeasurement,2013,AnalyticalBiochemistry)。但這些方法都要用到切刻內(nèi)切酶,制備含有單鏈區(qū)域的質(zhì)粒(即"GappedDNA"),實驗步驟較為繁瑣。另有學者擴增含有部分抗性基因片段的LacZa基因,然后利用載體與片段間抗性基因的功能性互補消除背景干擾,如WayneM.Barne等(ThefidefityofTaqpolymerasecatalyzingPCRisimprovedbyanN-terminaldeletion,1992,Gene)。但該方法擴增插入片段時,可能在抗性基因片段上出現(xiàn)突變,使得重組質(zhì)粒無法正常生長,導致克隆數(shù)減少,低估DNA聚合酶的錯配率。[0003]因此,需要提供一種操作簡便、準確的DNA聚合酶錯配率的檢測方法?!?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種操作簡便、準確的DNA聚合酶錯配率的檢測方法。[0005]為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:[0006]一種DNA聚合酶錯配率的檢測方法,該方法包括如下步驟:[0007]1)制備含有突變型ccdB基因的質(zhì)粒,其中所述突變型ccdB基因是通過同義突變在野生型ccdB基因內(nèi)引入內(nèi)切酶的酶切位點,所述酶切位點在所述質(zhì)粒上是唯一的;[0008]2)內(nèi)切酶酶切,獲得線性化質(zhì)粒;[0009]3)擴增LacZa基因;[0010]4)將步驟3)獲得的LacZa基因連接到所述線性化質(zhì)粒,獲得連接產(chǎn)物;[0011]5)轉(zhuǎn)化所述連接產(chǎn)物至宿主菌,并在培養(yǎng)基上進行培養(yǎng);[0012]6)計算錯配率。[0013]本發(fā)明所述同義突變是指:通過突變獲得與野生型ccdB基因(見序列表SEQIDNo.2)DNA序列不同的突變型ccdB的DNA序列,但是突變型ccdB基因編碼的ccdB蛋白序列與野生型ccdB基因編碼的蛋白序列相同。同義突變的目的是為了在野生型ccdB基因的DNA序列內(nèi)引入內(nèi)切酶的酶切位點,即突變型ccdB基因具有內(nèi)切酶酶切位點。突變型ccdB基因通過同義突變獲得的酶切位點應(yīng)該在步驟1)所述的質(zhì)粒上是唯一的。優(yōu)選地,酶切位點位于突變型ccdB基因序列中間靠近5'端部分。優(yōu)選地,酶切位點為高效內(nèi)切酶識別的位點。[0014]本發(fā)明方法的原理是:ccdB基因是致死基因,其編碼毒素蛋白ccdB,含有ccdB基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對ccdB蛋白無抗性的宿主菌體,將會導致宿主菌體的死亡。LacZa基因編碼β-半乳糖苷酶(簡稱β-gal)。β-gal比較穩(wěn)定,用X-Gal為底物進行染色時,呈藍色。LacZa基因插入突變型ccdB基因中,破壞了突變型ccdB基因的編碼序列,使其不能表達ccdB蛋白(如圖1和6所示)。[0015]DNA聚合酶擴增LacZa基因,并將其連接到含有突變型ccdB基因的質(zhì)粒中,然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入對ccdB蛋白無抗性的宿主菌體。當LacZa基因不能插入到突變型ccdB基因時,突變型ccdB基因表達ccdB蛋白,會造成宿主菌體的死亡;當LacZa基因插入到突變型ccdB基因時,突變型ccdB基因不表達ccdB蛋白,而表達β-gal,如果LacZa基因無突變,用X-Gal為底物進行染色時,呈藍色(藍斑),如果LacZa基因有突變,用X-Gal為底物進行染色時,呈白色(白斑),白斑數(shù)量與藍斑數(shù)量之和為總菌斑數(shù)量。白斑數(shù)量越多,則DNA聚合酶的錯配率越高,反之則越低。[0016]錯配率直接反映DNA聚合酶的保真性一錯配率越高,保真性越低。因此可以直接將錯配率作為保真性的評價指標。在PCR體系與條件相同的情況下,用不同PCR酶擴增LacZa基因(如圖5所示)并完成上述實驗,便可以根據(jù)數(shù)據(jù)比較不同DNA聚合酶的保真性。即DNA聚合酶的錯配率計算方法為:[0017](1-錯配率)x=藍斑數(shù)/總菌斑數(shù)[0018]將上式變形,最終可得:[0019][0020]其中,步驟(1)中含有突變型ccdB基因的質(zhì)粒構(gòu)建方法可采用常規(guī)的構(gòu)建方法,如對含有野生型ccdB基因的質(zhì)粒進行點突變,或通過PCR的方法突變野生型ccdB基因以獲得突變型ccdB基因,然后將突變型ccdB基因的PCR產(chǎn)物或其內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物連接到載體上,或者通過基因重組的方法連接到載體上,或者其他能夠?qū)崿F(xiàn)相同目的的實驗手段,其中所述載體不含有可表達ccdB蛋白的基因,或可表達與ccdB蛋白相同功能產(chǎn)物的基因。[0021]優(yōu)選地,步驟4)所述LacZα基因連接到所述線性化質(zhì)粒的方法為基因重組或通過DNA連接酶連接。通過基因重組,所述LacZa基因插入到突變型ccdB基因中。其中所述LacZα基因的DNA序列見序列表SEQIDNo.1。[0022]優(yōu)選地,步驟1)所述的質(zhì)粒不表達抗ccdB蛋白毒性的基因。[0023]優(yōu)選地,步驟2)中酶切時內(nèi)切酶識別的位點為步驟1)引入的酶切位點。[0024]優(yōu)選地,步驟5)所述宿主菌為對ccdB蛋白毒性無抗性的細菌,更優(yōu)選為對ccdB蛋白無抗性的大腸桿菌,如DH5α、ToplO或Transl-Tl。[0025]優(yōu)選地,步驟5)所述培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基。優(yōu)選地所述培養(yǎng)基含有X-gal和IPTG,其中X-gal和IPTG的用量為本領(lǐng)域的常規(guī)用量。宿主菌的培養(yǎng)時間根據(jù)菌體性質(zhì)決定。培養(yǎng)結(jié)束后分別計算其中藍斑和白斑的數(shù)量,藍斑和白斑的數(shù)量之和為總菌斑數(shù)量。所述錯配率的計算方法為:[0026](1-錯配率)x=藍斑數(shù)/總菌斑數(shù)[0027]將上式變形,最終可得:[0028][0029]本發(fā)明的有益效果如下:[0030]與傳統(tǒng)方法相比,本發(fā)明提供的一種將LacZa基因插入突變型ccdB基因的DNA聚合酶錯配率檢測方法,具有操作簡單、快速且成本低的特點。【附圖說明】[0031]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。[0032]圖1示出制備方法原理圖[0033]圖2不出pEASY-BluntZeroCloningVector質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。[0034]圖3不出缺失LacZa基因后的pEASY-BluntZeroCloningVector(記為PlasmidI)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。[0035]圖4示出突變后的Plasmid1質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。[0036][0037]圖5示出LacZα基因的PCR擴增產(chǎn)物。[0038]圖6示出LacZa基因在突變產(chǎn)生的酶切位點處插入ccdB基因后,生成的重組質(zhì)粒?!揪唧w實施方式】[0039]為了更清楚地說明本發(fā)明,下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解,下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的,不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護范圍。[0040]實施例中所用的材料及來源分別為:pEASY_BluntZeroCloningVector、EasyTaqDNAPolymerase、TransTaqHiFiDNAPolymerase、TransStartFastPfuDNAPolymerase、FastMutagenesisSystem、EasyPureQuickGelExtractionKit、T4DNALigase、pEASY-UniSeamlessCloningandAssemblyKit、Transl_TlPhageResistantChemicallyCompetentCell(北京全式金生物技術(shù)有限公司),SmaI、EcoRV限制性內(nèi)切酶(NEB公司),OneShot?ccdBSurvival?2TlRCompetentCells(感受態(tài)細胞)、引物合成、測序(Lifetechnologies公司)。[0041]實施例1:DNA聚合酶錯配率的檢測[0042]1.制備含有野生型ccdB基因的質(zhì)粒[0043]用反向PCR然后自連的方法,缺失pEASY-BluntZeroCloningVector載體中的LacZa基因,僅保留載體上的野生型ccdB基因。[0044]反向PCR引物為5'磷酸化引物,序列如下:[0045]PlasmidIPrimerF:5'-CAGTTTAAGGTTTACACC-3'(見序列表SEQIDNo.3)[0046]PlasmidIPrimerR:5'-CATAGCTGTTTCCTGTGTG-3'(見序列表SEQIDNo.4)[0047]pEASY-BluntZeroCloningVector為模板(Template),其含有LacZα與ccdB的融合基因,質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖2所示,PCR反應(yīng)體系如下:[0048]pEASY-BluntZeroCloningVectorIμLPlasmidIPrimerF(10μΜ)IμLPlasmidIPrimerR(10μΜ)IμL2><TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)25μLddH20加至50μ1[0049]PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘;94°C20秒,55°C20秒,72°C1分鐘,共25個循環(huán);72°C10分鐘;PCR結(jié)束后,取5μ1于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。[0050]然后用EasyPureQuickGelExtractionKit回收純化PCR產(chǎn)物,用T4DNALigase自連,轉(zhuǎn)化OneShot?ccdBSurvival?2TlRCompetentCells(感受態(tài)細胞),挑單克隆,測序驗證,對測序正確的菌落提質(zhì)粒,質(zhì)粒記為Plasmid1。[0051]2.含有突變型ccdB基因的質(zhì)粒的構(gòu)建:[0052]在野生型ccdB基因中突變產(chǎn)生SmaI酶切位點。[0053]野生型ccdB基因突變引物如下:[0054]MutationForwardPrimer:5'-GATATTATTGACACCCCGGGGCGACG-3'(見序列表SEQIDNo.5)[0055]MutationReversePrimer:5'-GGTGTCAATAATATCACTCTGTACA-3'(見序列表SEQIDNo.6)[0056]Plasmid1為模板(Template),其含有野生型ccdB基因,質(zhì)粒結(jié)構(gòu)如圖3所示,突變反應(yīng)體系如下:[0057]Plasmid110ngMutationForwardPrimer(10μΜ)IμLMutationReversePrimer(10μΜ)IμL2><TransStartFastPfuPCRSuperMix(-dye)25μΙddH2O加申.50μL[0058]PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘;94°C20秒,55°C20秒,72°C1分鐘,共25個循環(huán);72°C10分鐘;PCR結(jié)束后,取5μ1于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。[0059]然后用DMT酶(或DpnI酶)消化PCR產(chǎn)物,取2μ1酶消化產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化OneShot?cc當前第1頁1 2 
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