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用于保持已手術(shù)去除的組織中的癌細胞活力的方法和試劑的制作方法

文檔序號:9400843閱讀:873來源:國知局
用于保持已手術(shù)去除的組織中的癌細胞活力的方法和試劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生成用于已手術(shù)切除的癌組織的穩(wěn)定、保存和活力的試劑以及試劑組 合物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾十年來,用來檢測來自切除組織的癌細胞的用于病理分析的手術(shù)組織收集已經(jīng) 成為癌癥診斷的標準實踐。當前的組織樣品收集方案要求將切除組織收集并置于福爾馬林 溶液中,并隨后將其運送到病理實驗室進行染色和分析。遺憾的是,福爾馬林固定細胞(例 如,殺死細胞)并且在這一過程中引起細胞完整性的顯著改變,從而在準確地進行基因組 檢測(RNA、mRNA和蛋白質(zhì)生物標志物分析,和基因表達研究)分析的能力方面產(chǎn)生問題。
[0003] 分子技術(shù),如采用實時聚合酶鏈反應技術(shù)(RT-PCR)進行的基因組檢測,已發(fā)展到 某些癌癥可以匹配于特定的化學療法的程度,該化學療法已被證明響應于在癌細胞中發(fā)現(xiàn) 的某些基因表達譜。因此,能夠獲得從患者切除的癌細胞的準確基因表達譜允許通過設(shè)計 個性化的化學療法以及其他處理來進行個性化健康照護。這是治療范例的非常重要的轉(zhuǎn) 變,并將代表在不久的將來的醫(yī)護標準。
[0004] 已在福爾馬林中保存的癌組織樣品并非用于完成基因表達分析的活的組織樣品。 福爾馬林并非對組織樣品實現(xiàn)基因表達分析的良好試劑的一個原因是,福爾馬林導致蛋白 質(zhì)緩慢交聯(lián)成網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò),并且由于有價值的靶蛋白質(zhì)沒有針對降解得到保護,因此它們可 能被福爾馬林處理破壞。
[0005] 此外,隨著福爾馬林滲透組織樣品,發(fā)生細胞死亡(凋亡)。癌細胞是獨特的,因為 它們具有代謝性預程序化凋亡,從而在福爾馬林中發(fā)生加速的凋亡。隨著組織樣品中的細 胞死亡,總細胞群體的子集裂解并釋放寬范圍的內(nèi)部調(diào)節(jié)酶,這些內(nèi)部調(diào)節(jié)酶進一步導致 細胞死亡加速。這些酶中的許多酶將降解或破壞靶核酸〇嫩4嫩、11^嫩、調(diào)節(jié)蛋白以及在分 子基因組分析中使用的相關(guān)生物標志物。在固定過程中,福爾馬林殺死了組織樣品中的細 胞,而基因表達可成為不穩(wěn)定的,并且關(guān)鍵基因的基因組表達可變得欠表達或過表達,從而 產(chǎn)生某些癌基因的表達的不準確值。這是在基于來自選定基因的特定mRNA的水平作出化 學療法決定時的主要問題。因此,當前不可能對在福爾馬林中固定的癌細胞獲得準確的基 因組檢測。
[0006] 還應當注意的是,用福爾馬林固定組織樣品中的蛋白質(zhì)和細胞需要約48小時才 發(fā)生。這使得福爾馬林過程不能非常準確地確定在從患者收集組織時有什么樣的基因表 達。
[0007] 通常,從組織固定獲得的遺傳數(shù)據(jù)的科學有用性與組織的質(zhì)量和該組織對于基因 組檢測的有用性直接相關(guān)。目前,福爾馬林固定在獲得準確的基因表達信息方面并不是非 常有用的。因此,需要這樣的試劑:其用于固定組織樣品,以使得所收集的樣品包含用于遺 傳檢測的準確基因表達標志物。
[0008] 還需要不像福爾馬林那樣危險的組織樣品固定試劑。遺憾的是,福爾馬林給使用 者帶來顯著的癌癥風險,以及關(guān)于含福爾馬林產(chǎn)品的使用和處置的重要州及聯(lián)邦規(guī)定。
[0009] 本發(fā)明公開了用于制備允許收集從患者中手術(shù)去除的癌組織的試劑和試劑組合 物的方法,其中組織樣品中的癌細胞的遺傳細胞信息保持在活的狀態(tài),使得組織樣品適合 于基因表達分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明公開了制備用于組織樣品如活檢樣品的細胞活力試劑的新方法,該細胞活 力試劑允許樣品中細胞的基因表達分析。
[0011] 在制備用于組織樣品的試劑的方法的大多數(shù)實施方案中,該方法包括:提供至少 一種離液劑(Chaotrope),提供至少一種穩(wěn)液劑(kosmotrope),提供螯合劑,提供緩沖液, 提供凋亡底物,提供代謝調(diào)節(jié)劑,以及將所述離液劑、穩(wěn)液劑、螯合劑、緩沖液、凋亡底物以 及代謝調(diào)節(jié)劑以能夠進行組織樣品的基因表達分析的方式混合。
[0012] 在制備用于組織樣品的試劑的方法的許多實施方案中,所述凋亡底物是癌細胞凋 亡底物并且所述組織樣品是手術(shù)切除的癌組織。
[0013] 在本發(fā)明方法的大多數(shù)實施方案中,在用于組織樣品的試劑中,所述離液劑的最 終濃度為約0. 1摩爾(Molar)至約2摩爾,所述穩(wěn)液劑的最終濃度為約0. 1摩爾至約2 摩爾,所述螯合劑的最終濃度為約〇. 1摩爾至約2摩爾,且所述凋亡底物的最終濃度為約 0. 001摩爾至約0. 5摩爾。
[0014] 在本發(fā)明方法的某些實施方案中,所述離液劑選自SCN(硫氰酸鈉)、H2PO4、HCO3、 1、Cl、NO3、NH4、Cs、K+、(NH4)C+胍、胍的所有鹽、Br或Rb。
[0015] 在制備所述試劑的方法的一些實施方案中,所述至少一種穩(wěn)液劑選自甘油、三甲 胺N-氧化物、依克多因(Ectoine)、aa_海藻糖、3-二甲基锍丙酸鹽、葡萄糖、葡聚糖或D-乳 糖。
[0016] 在其他實施方案中,所述螯合劑選自EDTA、EGTA或BABTA。
[0017] 在本發(fā)明方法的另一實施方案中,所述緩沖液選自BIS-TRIS、BIS-TRIS丙烷、 HEPES、HEPES鈉鹽、MES、MES鈉鹽、MOPS、MOPS鈉鹽、鈉鹽或磷酸鈉緩沖液(單堿式、三堿式 PO4) 〇
[0018] 在所述方法的又一實施方案中,所述凋亡底物選自DMS0、瘦素、甘氨酸甜菜堿 (Glycinebeatine)、檸檬酸鉀、三甲胺、脯氨酸、NDSB195、ML-精氨酸、木糖醇、亞硒酸鈉、 NDSB201、CuCL2SCTAB。
[0019] 在一些實施方案中,所述代謝調(diào)節(jié)劑選自極性非質(zhì)子溶劑、DMS0、丙酮、N,N-二 甲基甲酰胺或乙腈。
[0020] 在大多數(shù)實施方案中,制備所述試劑的方法進一步包括將所述試劑的各種組分按 照以下的相繼順序添加至凈化水的整分試樣中:添加至少一種離液劑,接著添加所述螯合 劑,接著添加所述代謝調(diào)節(jié)劑,接著添加第一穩(wěn)液劑,接著添加所述緩沖液,接著添加不同 于第一穩(wěn)液劑的第二穩(wěn)液劑,最后接著添加所述凋亡底物。
[0021] 在本發(fā)明的許多實施方案中,所述離液劑是SCN(硫氰酸鈉),所述第一穩(wěn)液劑是 甘油而所述第二穩(wěn)液劑是aa-海藻糖,所述螯合劑是EDTA,所述緩沖液是磷酸鈉緩沖液(單 堿式、三堿式PO4),所述細胞凋亡底物是瘦素,且所述代謝調(diào)節(jié)劑是DMS0。
[0022] 在另一實施方案中,制備用于分析組織樣品的試劑的方法包括:提供凈化水的 整分試樣;將所述試劑的組分按照以下順序添加至所述凈化水中:添加硫氰酸鈉、H)TA、 DMS0、甘油、磷酸鉀緩沖液以及aa-海藻糖,接著添加人瘦素;以及在各種組分的各次添加 之間以允許組織樣品或活檢組織的準確基因表達分析的方式混合所述組分。
[0023] 在一些實施方案中,制備用于分析組織樣品的試劑的方法包括:提供凈化水的整 分試樣;將所述試劑的組分按照以下順序添加至所述凈化水中:添加至少一種離液劑,接 著添加螯合劑,接著添加代謝調(diào)節(jié)劑,然后添加第一穩(wěn)液劑,然后添加緩沖液,接著添加不 同的第二穩(wěn)液劑,接著添加凋亡底物;以及在各次組分添加之間以允許組織樣品的準確基 因表達分析的方式混合所述組分。
[0024] 在大多數(shù)實施方案中,用于制備組織樣品的、允許基因表達分析的試劑包含:至少 一種離液劑、至少一種穩(wěn)液劑、螯合劑、緩沖液、凋亡底物以及代謝調(diào)節(jié)劑。
[0025] 為分析癌組織樣品,所述凋亡底物是癌細胞凋亡底物。
[0026] 對于所述試劑的大多數(shù)實施方案,所述離液劑的最終濃度為約0. 1摩爾至約2摩 爾,所述至少兩種穩(wěn)液劑中每種穩(wěn)液劑的最終濃度為約〇. 1摩爾至約2摩爾,所述螯合劑的 最終濃度為約〇. 1摩爾至約2摩爾,且所述凋亡底物的最終濃度為約0. 001摩爾至約0. 5 摩爾。
[0027] 在所述試劑的具體實施方案中,所述離液劑是SCN(硫氰酸鈉),所述穩(wěn)液劑是甘 油和aa-海藻糖,所述螯合劑是EDTA,所述緩沖液是磷酸鈉緩沖液(單堿式、三堿式PO4), 所述細胞凋亡底物是瘦素,且所述代謝調(diào)節(jié)劑是DMS0。
[0028] 在所述試劑的一些實施方案中,所述離液劑選自SCN(硫氰酸鈉)、H2PO4、HCO3、 I、Cl、NO3、NH4、Cs、K+、(NH4)C+胍、胍的所有鹽、Br或Rb。
[0029] 在所述試劑的其他實施方案中,所述穩(wěn)液劑選自甘油、三甲胺N-氧化物、依克多 因、aa-海藻糖、3-二甲基锍丙酸鹽、葡萄糖、葡聚糖或D-乳糖。
[0030] 在所述試劑的又一實施方案中,所述螯合劑選自EDTA、EGTA或BABTA。
[0031] 一些實施方案中的保存試劑包括選自BIS-TRIS、BIS-TRIS丙烷、HEPES、HEPES鈉 鹽、MES、MES鈉鹽、MOPS、MOPS鈉鹽、鈉鹽或磷酸鈉緩沖液(單堿式、三堿式PO4)的緩沖液。
[0032] 在所述試劑的其他實施方案中,所述凋亡底物選自DMS0、瘦素、甘氨酸甜菜堿、檸 檬酸鉀、三甲胺、脯氨酸、NDSB195、ML-精氨酸、木糖醇、亞硒酸鈉、NDSB201、CuCL2SCTAB。
[0033] 所述試劑的又一實施方案包含選自極性非質(zhì)子溶劑、DMS0、丙酮、N,N-二甲基甲 酰胺或乙腈的代謝調(diào)節(jié)劑。
[0034] 本文中提到的所有專利和出版物均通過引用整體并入本文。
【附圖說明】
[0035] 圖1是一張流程圖,其示出了根據(jù)本發(fā)明制備用于手術(shù)去除組織、允許組織樣品 的基因表達分析的試劑的方法的一個實施方案。
[0036] 圖2是一張流程圖,其示出了根據(jù)本發(fā)明制備用于手術(shù)去除組織尤其是癌組織、 允許組織樣品的基因表達分析的試劑的方法的一個實施方案。
[0037] 圖3A和3B是配制列表,其示出了根據(jù)本發(fā)明的用于保存組織樣品的試劑的組分 以及各個組分的相繼添加的一個實施方案。
[0038] 圖4是來自老化LNCa-FGC細胞的PGK基因的rtPCR結(jié)果的曲線圖,其中比較了根 據(jù)本發(fā)明的細胞保存試劑的一個實施方案與常規(guī)保存試劑的使用。
[0039] 圖5是來自老化PC3癌細胞的PB⑶基因的mRNA拷貝的曲線圖,其中比較了根據(jù) 本發(fā)明的細胞保存試劑的一個實施方案與常規(guī)試劑的rtPCR結(jié)果。
[0040] 圖6是各種老化腎癌細胞的G6PDH的mRNA拷貝的曲線圖,其中比較了保存試劑的 一個實施方案與常規(guī)保存溶液的使用。
[0041] 圖7是比較在老化腎癌細胞上使用的保存試劑的三個不同實施方案的曲線圖。
【具體實施方式】
[0042] 除非另有說明,本申請(包括說明書和權(quán)利要求書)中使用的以下術(shù)語具有下文 給出的定義。必須要注意的是,除非上下文另外明確指示,如在說明書和所附權(quán)利要求書中 使用的單數(shù)形式"一個"、"一種"和"該"包括復數(shù)指示物。
[0043] "任選的"或"任選地"意
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