含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,以每孔10,〇〇〇個(gè)細(xì)胞接 種到12孔板,每孔體積為I ml; ② 培養(yǎng)細(xì)胞:5% C02,37°C孵育24 h,至細(xì)胞單層鋪滿孔底; ③ 藥物處理:加入制備出的BSNQ(IC5t): 1.40 μΜ),處理不同時(shí)間(0,3,6,12,24 h); ④ 用PBS洗滌2次,加入 195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液,再加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻; ⑤ 加入10 μL碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液,輕輕混勾; ⑥ 室溫(20-25°C)避光孵育15分鐘; ⑦ (A)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及顏色的改變,綠色熒光為Annexin V-FITC染 色陽(yáng)性細(xì)胞,紅色熒光為碘化丙啶陽(yáng)性細(xì)胞。僅被綠色熒光染色,且體積較小的細(xì)胞為凋亡 細(xì)胞;被紅色或綠色和紅色雙染,且體積較大的細(xì)胞為壞死細(xì)胞;未被染色的細(xì)胞為正常細(xì) 胞。隨機(jī)觀察200個(gè)細(xì)胞,求得各種細(xì)胞所占的百分比,每個(gè)樣本計(jì)數(shù)3次取平均。(B)同時(shí), 也利用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)BSNQ對(duì)人肝癌細(xì)胞的凋亡。
[0023] 1、用BSNQ處理Hep3B細(xì)胞,檢測(cè)BSNQ對(duì)人肝癌Hep3B細(xì)胞的凋亡 采用上述實(shí)驗(yàn)方法,得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4A、圖4B、圖5A及圖5B,其中圖4A是用BSNQ處 理Hep3B細(xì)胞后,利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況圖,shikonin和5-FU為陽(yáng)性對(duì)照組;圖 4B是圖4A的定量分析圖。圖5A是用BSNQ和OSNQ處理Hep3B細(xì)胞后,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì) 胞凋亡情況圖;圖5B是圖5A的定量分析圖。
[0024]結(jié)果分析 用BSNQ(終濃度為1.40 μΜ)處理人肝癌Hep3B細(xì)胞0、3、6、12、24 11后,進(jìn)行4111161丨11¥-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn),并在熒光顯微鏡觀察。從圖4B中可以看出,隨著藥物處理時(shí)間的不斷增 加 ,Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng),其細(xì)胞凋亡程度也顯著增加。尤其當(dāng)時(shí)間為24 h 時(shí),細(xì)胞的熒光強(qiáng)度最高。結(jié)果說(shuō)明,BSNQ可以有效誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞的凋亡,并呈時(shí)間依賴 性。
[0025]用BSNQ(終濃度為1.40 μΜ)處理人肝癌Hep3B細(xì)胞0、3、6、12、24 11后,進(jìn)行4111^^111 V-FITC和PI進(jìn)行標(biāo)記,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。從圖5B中可以看出,隨著藥物處 理時(shí)間的不斷增加,肝癌Hep3B細(xì)胞凋亡的程度也隨之增加,尤其當(dāng)藥物處理時(shí)間達(dá)到24 h 時(shí),細(xì)胞的凋亡水平明顯增加。這一結(jié)果說(shuō)明,BSNQ可以有效誘導(dǎo)Hep3B的凋亡,并呈時(shí)間依 賴性。
[0026] 2、用BSNQ處理HepG2細(xì)胞,檢測(cè)BSNQ對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡 采用上述實(shí)驗(yàn)方法,得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6A及圖6B,其中圖6A是用BSNQ處理HepG2細(xì) 胞后,利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況圖,hikonin和5-FU為陽(yáng)性對(duì)照組;圖6B是6A圖的 定量分析圖。
[0027]結(jié)果分析 用BSNQ(終濃度為1.40 μΜ)處理人肝癌HepG2細(xì)胞0、3、6、12、24 11后,進(jìn)行4111161丨11¥-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn),并在熒光顯微鏡觀察。從圖6B中可以看出,隨著藥物處理時(shí)間的不斷增 加 ,Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng),其細(xì)胞凋亡程度也顯著增加。尤其當(dāng)時(shí)間為24 h 時(shí),細(xì)胞的熒光強(qiáng)度最高。BSNQ可以有效誘導(dǎo)!fepG2細(xì)胞的凋亡,并呈時(shí)間依賴性。
[0028] 3、用BSNQ處理Huh7細(xì)胞,檢測(cè)BSNQ對(duì)人肝癌Huh7細(xì)胞的凋亡 采用上述實(shí)驗(yàn)方法,得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7A及圖7B,其中圖7A是用BSNQ處理Huh7細(xì)胞 后,利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況圖,shikonin和5-FU為陽(yáng)性對(duì)照組;圖7B是圖7A的定 量分析圖。
[0029]結(jié)果分析 用83購(gòu)(終濃度為1.40以1〇處理人肝癌肋117細(xì)胞0、3、6、12、24 11后,進(jìn)行4111161丨11¥-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn),并在熒光顯微鏡觀察。從圖7B中可以看出,隨著藥物處理時(shí)間的不斷增 加 ,Annexin V-FITC熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng),其細(xì)胞凋亡程度也顯著增加。尤其當(dāng)時(shí)間為24 h 時(shí),細(xì)胞的熒光強(qiáng)度最高。BSNQ和OSNQ可以有效誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞的凋亡,并呈時(shí)間依賴性。 [0030] 綜上所述,BSNQ(IC5t): 1.40 μΜ)可以誘導(dǎo)人肝癌Hep3B、!fepG2和Huh7細(xì)胞的凋亡, 其癌細(xì)胞凋亡能力隨著時(shí)間的增加而逐漸升高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種2-丁亞砜-1,4-萘醌的制備方法,具體按照以下步驟進(jìn)行: (1) 2-丁巰基-1,4-萘醌的合成 在反應(yīng)容器中加入1,4_萘醌和甲醇,甲醇的量滿足充分溶解1,4_萘醌即可,二者混合 均勻后加入1-丁硫醇,1-丁硫醇與1,4_萘醌的摩爾比為1.5:1,室溫下反應(yīng)3-5小時(shí)后,向反 應(yīng)容器中加入重鉻酸鈉和濃硫酸,重鉻酸鈉與1,4-萘醌的摩爾比為1:5,濃硫酸與1,4-萘醌 的摩爾比為3:4,繼續(xù)反應(yīng)5-10分鐘;然后用二氯甲燒和飽和食鹽水萃取,無(wú)水硫酸鈉干燥, 過(guò)濾,濃縮至干燥,得2-丁巰基-1,4-萘醌; (2) 2-丁亞砜-1,4-萘醌的合成 在反應(yīng)瓶中,加入步驟(1)產(chǎn)物2-丁巰基-1,4-萘醌和氯仿,氯仿的量滿足充分溶解2-丁巰基-1,4-萘醌即可,繼續(xù)加入3-氯過(guò)氧苯甲酸,3-氯過(guò)氧苯甲酸與2-丁巰基-1,4-萘醌 的摩爾比為1.2:1,0°C溫度下反應(yīng)1.5-2.5小時(shí),反應(yīng)完全后加入5% NaHC03溶液中和反應(yīng) 中過(guò)剩的3-氯過(guò)氧苯甲酸后終止反應(yīng);反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)二氯甲烷和飽和食鹽水萃取,無(wú)水硫酸 鈉干燥,過(guò)濾,濃縮至干燥,得2-丁亞砜-1,4-萘醌。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種2-丁亞砜-1,4-萘醌的制備方法,解決了現(xiàn)有僅從植物中提取和分離萘醌類化合物遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足研究和應(yīng)用需求的問(wèn)題。具體分兩步進(jìn)行,首先合成2-丁巰基-1,4-萘醌,使1-丁硫醇與1,4-萘醌室溫下反應(yīng)3-5小時(shí)后,加入重鉻酸鈉和濃硫酸,繼續(xù)反應(yīng)5-10分鐘后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行后處理得2-丁巰基-1,4-萘醌;然后合成2-丁亞砜-1,4-萘醌,將2-丁巰基-1,4-萘醌與3-氯過(guò)氧苯甲酸在0℃溫度下反應(yīng)1.5-2.5小時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)后處理得2-丁亞砜-1,4-萘醌。本發(fā)明制備方法的合成路線簡(jiǎn)單,反應(yīng)溫度低,得到的2-丁亞砜-1,4-萘醌產(chǎn)物,抗癌效果明顯,而且對(duì)癌細(xì)胞的選擇性高。
【IPC分類】C07C315/02, C07C317/12
【公開(kāi)號(hào)】CN105541678
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610046372
【發(fā)明人】金成浩, 孫虎男, 羅英花, 臧延青, 申貴男, 劉暢, 吳丹丹, 蔣雪園, 孟令旗, 王浩, 徐婉婷
【申請(qǐng)人】黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月25日