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用于上皮組織腫瘤細胞的檢測劑組合物及其制備方法

文檔序號:9749127閱讀:1120來源:國知局
用于上皮組織腫瘤細胞的檢測劑組合物及其制備方法
【專利說明】
[00011 本發(fā)明是基于申請日為2011年12月29日,申請?zhí)枮?201110449270.7",發(fā)明名稱 為"用于上皮組織腫瘤細胞的檢測劑組合物及其制備方法"的專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及一種檢測劑組合物,特別涉及一種用于上皮組織腫瘤細胞的基于顏色 變化的檢測劑組合物。本發(fā)明還涉及制備所述檢測劑組合物的方法,以及包含所述檢測劑 組合物的試劑盒。
【背景技術】
[0003] 目前,用于對人體上皮組織腫瘤細胞進行活體染色的方法主要有基于乙酸白化反 應的方法、碘實驗、甲苯胺藍實驗、亞甲基藍染色、蘇木素染色等。
[0004] 具體而言,乙酸白化反應是通過將乙酸溶液,例如3-5 %的乙酸溶液,涂抹在宮頸/ 陰道上皮組織上,等待一段時間之后觀察所涂抹的上皮組織有無乙酸白化反應區(qū),如果有 白化區(qū),則該上皮組織懷疑有腫瘤細胞。然而,此方法雖然敏感性高,但是特異性差,因為除 了腫瘤細胞之外,部分炎癥細胞也可以產(chǎn)生乙酸白化反應,因而產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。并且該 方法的特異性受操作者的技術水平和經(jīng)驗影響較大。
[0005] 碘實驗的原理是糖原反應,是將盧戈氏碘液涂抹在宮頸上皮組織上,然后通過觀 察上皮細胞的碘染現(xiàn)象來進行的檢測。其中,正常上皮呈赤棕色或黑色,而異常上皮呈厚的 芥末黃或土黃色。但是,在上皮有炎癥時,這些區(qū)域可能不會受到染碘,或是呈現(xiàn)無色的裝 填,所以碘實驗對上皮細胞染色的特異性較低 [1]。
[0006] 使用甲苯胺藍的方法易使中性白細胞和細菌的核碎片著色,導致較多假陽性,對 表面有角化的粘膜白斑和癌不易著色,易造成假陰性 [2]。
[0007] 上皮組織蘇木素染色后需要借助高倍顯微鏡進行觀察,操作相對復雜,對操作者 的專業(yè)技術和經(jīng)驗要求較高,且檢查費時較長。
[0008] 亞甲基藍與癌細胞的親和性使惡性組織易于染成藍色,有研究將其用于食道上皮 組織的定位活檢取材,其具有提高活檢陽性率的作用 [3]。但是,現(xiàn)有技術中還沒有將亞甲基 藍的氧化還原變色反應與葉酸、葉酸復合物組合使用,通過染色和顏色變化反應快速定位 和檢測上皮腫瘤細胞的報道。
[0009] 本領域急需一種準確率高、特異性強、操作簡便快捷的對上皮組織腫瘤細胞通過 染色和顏色變化進行檢測的組合物,特別是用于宮頸/陰道上皮組織腫瘤細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),利用葉酸和/或葉酸復合物與腫瘤細胞中過度表達的葉酸 受體的相互作用,并結(jié)合亞甲基藍在氧化還原作用中的顏色變化,能夠迅速、準確地對異常 的上皮組織進行特異性染色,進而將其與正常組織進行區(qū)分,并通過本發(fā)明組合物的顏色 變化快速顯示受試的組織細胞是否為腫瘤細胞,由此提供了迅速、簡易、準確、靈敏的對異 常上皮組織的定位和檢測,由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明的檢測劑組合物敏感性高、特異性 高,操作簡便,檢查時間短,且操作者不需技術培訓。除此之外,亞甲基藍作為一種在臨床上 廣泛使用的試劑,具有有效、安全、低廉并且容易獲得的優(yōu)點,從而使得本發(fā)明的組合物和 方法也具有這些優(yōu)勢。
[0011] 因此,本發(fā)明提供了一種檢測劑組合物,所述組合物包含以下組分(按重量百分比 計): 葉酸 0-5% 葉酸復合物 0-丨0% 亞曱基藍 0.01-5%
[0012] 糖類還原劑 0,1-10% 乙酸 2-6% 水 3-95%
[0013] 在上述檢測劑組合物的優(yōu)選實施方案中,葉酸的含量優(yōu)選為0-4.5%,更優(yōu)選為Ο- ?%。
[0014] 在另一個優(yōu)選的實施方案中,葉酸復合物的優(yōu)選含量為0-8%,更優(yōu)選為0-1 %。 [0015]在另一個優(yōu)選的實施方案中,亞甲基藍的含量優(yōu)選為0.05-4.5%,更優(yōu)選為0.05-0.5%〇
[0016]在另一個優(yōu)選的實施方案中,乙酸的含量優(yōu)選為3-5%。
[0017] 本發(fā)明的檢測劑組合物中所用的糖類還原劑包括各種糖類及其衍生物,優(yōu)選葡萄 糖、果糖、半乳糖、己糖、乳糖、麥芽糖及其衍生物等。
[0018] 本發(fā)明的另一個方面涉及制備本發(fā)明的檢測劑的方法,所述方法依次包括以下步 驟或由以下步驟組成:
[0019] (a)按上述重量百分比將葉酸和/或葉酸復合物溶于含水溶劑中形成溶液,
[0020] (b)按上述重量百分比將亞甲基藍加入到溶液(a)中攪拌溶解,
[0021] (c)按上述重量百分比將糖類還原劑加入溶液(b)中,
[0022] (d)將步驟(c)中獲得的溶液攪拌30分鐘,
[0023] (e)按上述重量百分比將乙酸加入溶液(d)中攪拌混合,
[0024] 上述各步驟都是在常溫和常壓下進行的。
[0025] 在優(yōu)選的方面,根據(jù)本發(fā)明的檢測劑或根據(jù)本發(fā)明的方法制備的檢測劑用于上皮 組織腫瘤細胞。
[0026] 本發(fā)明還涉及一種檢測上皮組織病變的方法,所述方法包括:
[0027] (a)將本發(fā)明的活細胞檢測劑借由載體施用于受試者的上皮組織表面;
[0028] (b)觀察載體上的顏色變化;
[0029] (c)根據(jù)顏色變化決定所測試的上皮組織是否產(chǎn)生病變。
[0030] 在一個優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明涉及的檢測上皮組織病變的方法還包括:
[0031] (d)觀察施用了本發(fā)明的活細胞檢測劑的上皮組織表面區(qū)域中是否產(chǎn)生乙酸白化 反應。
[0032] 在一個優(yōu)選實施方案中,在本發(fā)明涉及的檢測上皮組織病變的方法中,在步驟(b) 中的觀察是通過肉眼進行的。
[0033] 在一個優(yōu)選實施方案中,在本發(fā)明涉及的檢測上皮組織病變的方法中,在步驟(b) 和(c)中的觀察和測定根據(jù)以下標準進行:載體無變色,提示上皮組織無病變;載體變?yōu)榫G 色或藍綠色,提示炎性病變、濕疣或CINI病變;載體顏色為紫黑色,提示CINII以上病變。進 一步而言,如果載體變?yōu)樽虾谏谡髑蠡颊咄獾那疤嵯?,在上皮組織產(chǎn)生乙酸白化反應 的區(qū)域取活組織送病理檢查分析。
[0034]在一個優(yōu)選的實施方案中,所述病變?yōu)樯掀そM織內(nèi)瘤變(CIN)和癌變。
[0035] 本發(fā)明的上皮組織腫瘤細胞的檢測劑組合物,可以通過不同的方式進行施用。所 述施用方式包括但不限于,涂抹。所述施用可以采用載體進行,所述載體包括但不限于脫脂 棉簽、紗布、微囊、纖維膜、濾紙等。
[0036] 本發(fā)明的上皮組織腫瘤細胞的檢測劑組合物,可以施用于不同部位的上皮組織, 包括但不限于宮頸、陰道、外陰、口腔等的上皮組織。
[0037] 本發(fā)明中涉及的百分比含量均為重量百分比,除非另行指明。
【具體實施方式】
[0038]臨床研究證明,葉酸受體在大多數(shù)腫瘤細胞表面過度表達,而在正常細胞中的存 在很少,所以葉酸以及葉酸復合物可以作為腫瘤特異性靶向介導分子,用于腫瘤的診斷和 治療[44]。
[0039] 在本發(fā)明中,術語"葉酸復合物"定義為葉酸分子與一種或多種另外的組分結(jié)合形 成的復合物。其中葉酸的羧基以偶聯(lián)或共輒等方式與所述一種或多種另外的組分結(jié)合。所 述一種或多種另外的組分可以是例如藥物、放射性核素、染料、基因、顯影劑等。所述葉酸復 合物的實例如葉酸-絲裂霉素復合物、葉酸-DTPA復合物等。在本發(fā)明的組合物和方法中,葉 酸和/或葉酸復合物可以同時使用,也可以單獨使用。葉酸在本發(fā)明的組合物中的含量以重 量百分比計為 0-5%,優(yōu)選為 0-4.5%,0-4%,0-3.5%,0-3%,0-2.5%,0-2%,0-1.5%,甚 至更優(yōu)選0-1%。葉酸復合物在本發(fā)明的組合物中的含量以重量百分比計為0-10%,優(yōu)選含 量為0-8 %,0-7 %,0-6 %,0-5 %,0-4 %,0-3 %,0-2 %,甚至更優(yōu)選0-1 %。
[0040] 亞甲基藍是一種臨床上常用的染色劑,其染色、變色原理主要是基于其在氧化態(tài) 和還原態(tài)中的不同顏色。具體而言,還原態(tài)的亞甲基藍是無色的,而氧化態(tài)的亞甲基藍呈藍 色。另外,亞甲基藍在存在于本發(fā)明的組合物中時,在受到氧化時也可以呈藍綠色和紫黑 色。生物染色劑亞甲基藍對癌細胞及黑色素有高度親和性 [7],其氧化還原性使亞甲基藍在 腫瘤組織的氧化還原態(tài)中表現(xiàn)不同的變色反應光譜,這種顏色變化能夠直接通過肉眼觀察 鑒定。
[0041] 腫瘤組織的抗氧化能力與一般正常組織相比明顯增強,但仍存在較明顯的氧化應 激狀態(tài)[6]。氧化應激(Oxidative Stress)狀態(tài)是組織氧化損傷的表現(xiàn),是潛隱性組織病理 漸進性變化過程。雖然腫瘤細胞的還原性增強,但其氧化還原平衡仍然傾向于氧化,除非腫 瘤細胞處于凋亡或抑制狀態(tài)。因此,在這種活細胞的胞內(nèi)環(huán)境下,本發(fā)明的組合物中的亞甲 基藍得到氧化,呈現(xiàn)出氧化態(tài)的綠色、藍綠色和紫黑色。
[0042]在本發(fā)明的組合物中,葉酸復合物以及少量的葉酸能夠與亞甲基藍形成葉酸-亞 甲基藍復合物,由于葉酸分子與腫瘤細胞表面過度表達的葉酸受體的結(jié)合作用,在乙酸的 促進下,葉酸-亞甲基藍復合物能夠更容易地進入細胞,并且釋放還原態(tài)的亞甲基藍,而在 腫瘤細胞的氧化應激態(tài)中,亞甲基藍迅速得到氧化,進而產(chǎn)生顏色變化,具體而言,亞甲基 藍變?yōu)樽虾谏诖嬖谘仔圆∽?、尖銳濕疣(HPV病毒感染)或CINI病變的情況下,亞甲基 藍的顏色為綠色或藍綠色。
[0043] 本發(fā)明中的"糖類還原劑"指任何具有還原性的糖類、其衍生物及其組合。所述糖 類包括但不限于單糖、二糖、多糖。具體而言,所述糖類還原劑可以為葡萄糖、果糖、半乳糖、 己糖、乳糖、麥芽糖等。本文中所述的"糖類衍生物"定義為糖類物質(zhì)通過聚合、酯化、氧化等 反應形成的如多糖、糖蛋白、有機酸等衍生物。糖類還原劑在本發(fā)明的組合物和方法中的量 為0.1-10%,優(yōu)選為
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